Preview

Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология

Расширенный поиск

Гетерологическая экспрессия и характеристика нового мутантного ДНК-связывающего белка из гипертермофильного микроорганизма Thermotoga naphthophila

https://doi.org/10.21285/2227-2925-2019-9-2-288-301

Полный текст:

Аннотация

Представлены данные по клонированию, гетерологической экспрессии и характеристике рекомбинантных гомологов ДНК-связывающего белка из гипертермофильного микроорганизма Thermotoga naphthophila (TnaDBP, TnaDBP-mut). Предварительно нуклеотидная последовательность исходного термостабильного белка TnaDBP подвергалась кодоновой оптимизации в соответствии с особенностями строения и работы системы нуклеинового обмена клеток мезофильной бактерии Escherichia coli, использовавшейся в дальнейшем в качестве лабораторного штамма-продуцента. Сконструированы экспрессионные векторные конструкции, обеспечивающие эффективную продукцию белков TnaDBP и TnaDBP-mut в клетках E. coli. Подобраны оптимальные условия культивирования трансформированных штаммов для биосинтеза растворимой формы целевого белкового продукта. Проведено аэробное культивирование микроорганизмов в контролируемых условиях. Были изучены особенности кинетики роста трансформированных клеток E. coli BL21(DE3)[pET-TnaDBP-mut]. При этом продемонстрировано, что время выхода роста культуры E. coli BL21(DE3)[pET-TnaDBP-mut], продуцирующей мутантный ДНК-связывающий белок на стационарную фазу при культивировании в жидкой питательной среде, составляет до 10 ч после внесения индуктора. Предложена малостадийная схема очистки полученных белков с использованием процедуры термолизиса. Проведена предварительная оценка растворимости и термостабильности белка по его первичной аминокислотной последовательности. Рассмотрены потенциальные области применения рекомбинантных вариантов термостабильного ДНК-связывающего белка TnaDBP. По результатам работы стало очевидно, что благодаря уникальным физ ико-химическим свойствам подобные белки представляют большой интерес с биотехнологической точки зрения и могут найти применение в различных отраслях промышленности в качестве источников незаменимых L-аминокислот для культур эукариотических клеток в качестве основы для энтерального питания сельскохозяйственных животных, а также в качестве необходимой компонентной базы при разработке невирусных векторных систем и белков-носителей в области биомедицины и фундаментальной науки.

Об авторах

Д. В. Гришин
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича
Россия

к.б.н., старший научный сотрудник, лаборатории медицинской биотехнологии,

Москва 



Д. Д. Жданов
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича
Россия

к.б.н., и.о. заведующего лабораторией медицинской биотехнологии,

Москва



Ю. А. Гладилина
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича
Россия

к.б.н., научный сотрудник лаборатории медицинской биотехнологии,

Москва



М. В. Покровская
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича
Россия

к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории медицинской биотехнологии,

Москва



С. С. Александрова
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича
Россия

к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории медицинской биотехнологии,

 



Н. Н. Соколов
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича
Россия

д.б.н., профессор, главный научный сотрудник лаборатории медицинской биотехнологии,

 



Список литературы

1. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. Molecular Biology of the Cell. Garland Science, 2008. 1392 p.

2. Perales C., Cava F., Meijer W.J.J., Berenguer J. Enhancement of DNA, cDNA synthesis and fidelity at high temperatures by a dimeric single-stranded DNA-binding protein // Nucleic Acids Research. 2003. Vol. 31. P. 6473–6480. DOI: 10.1093/nar/gkg865

3. Olszewski M., Grot A., Wojciechowski M., Nowak M., Mickiewicz M., Kur J. Characterization of exceptionally thermostable single-stranded DNAbinding proteins from Thermotoga maritima and Thermotoga neapolitana // BMC Microbiology. 2010. Vol. 10. P. 260. DOI: 10.1186/1471-2180-10-260.

4. Cernooka E., Rumnieks J., Tars K., Kazaks A. Structural Basis for DNA Recognition of a Singlestranded DNA-binding Protein from Enterobacter Phage Enc34 // Scientific Reports. 2017. Vol. 7. Issue 1. P. 15529. DOI: 10.1038/s41598-017-15774-y

5. Kur J., Olszewski M., Długołecka A., Filipkowski P. Single-stranded DNA-binding proteins (SSBs) – sources and applications in molecular biology // Acta Biochimica Polonica. 2005. Vol. 52. Issue 3. P. 569–574.

6. Гришин Д.В., Покровская М.В., Подобед О.В., Гладилина Ю.А., Покровский В.С., Александрова С.С., Соколов Н.Н. Прогнозирование термостабильности белков по их первичной структуре: современное состояние и факторы развития // Биомедицинская химия. 2017. Т. 63. N 2. C. 124–131.

7. Sterner R., Liebl W. Thermophilic adaptation of proteins // Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 2001, vol. 36, issue 1, pp. 39– 106. DOI: 10.1080/20014091074174

8. Ming D., Hellekant G. Brazzein, a new highpotency thermostable sweet protein from Pentadiplandra brazzeana B // FEBS Letters. 1994. Vol. 355. Issue 1. P. 106–108.

9. Grishin D.V., Gudov V.P., Sergienko O.V., Lunin V.G., Kharchenko P.N. Creation of a protein vector construct including an SSBTne DNA-binding domain and VirD2 nuclear localization signal // Russian Agricultural Sciences. 2008. Vol. 34. Issue 5. P. 329–331. DOI: 10.3103/S1068367408050145

10. Cuadros C., Lopez-Hernandez F.J., Dominguez A.L, McClelland M., Lustgarten J. Flagellin fusion proteins as adjuvants or vaccines induce specific immune responses // Infection and Immunity. 2004. Vol. 72. Issue 5. P. 2810–2816. DOI: 10.1128/IAI.72.5.2810-2816.2004

11. Rizzuto R., Brini M., Pizzo P., Murgia M., Pozzan T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells // Current Biology. 1995. Vol. 5. Issue 6. P. 635–642. https://doi.org/10.1016/S0960-9822(95)00128-X

12. Grishin D.V., Gladilina Y.A., Aleksandrova S.S., Pokrovskaya M.V., Podobed O.V., Pokrovskii V.S., Zhdanov D.D., Sokolov N.N. Creation of thermostable polypeptide cassettes for amino acid balancing in farm animal rations // Applied Biochemistry and Microbiology. 2017. Vol. 53. Issue 6. P. 688–698. DOI: 10.1134/S0003683817060072

13. Гришин Д.В., Подобед О.В., Гладилина Ю.А., Покровская М.В., Александрова С.С., Покровский В.С., Соколов Н.Н. Биоактивные белки и пептиды: современное состояние и новые тенденции практического применения в пищевой промышленности и кормопроизводстве // Вопросы питания. 2017. Т. 86. N 3. C. 19–31.

14. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Research. 1997. Vol. 25. Issue 17. P. 3389–3402. DOI: 10.1093/nar/25.17.3389

15. Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D.G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools // Nucleic Acids Research. 1997. Vol. 25. Issue 24. P. 4876–4882.

16. Kibbe W.A. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator // Nucleic Acids Researh. 2007. Vol. 35. P. 43–46. DOI: 10.1093/nar/gkm234

17. Ku T.H., Lu P.Y., Chan C.H., Wang T.S., Lai S.Z., Lyu P.C., Hsiao N.W. Predicting melting temperature directly from protein sequences // Computation Biology and Chemistry. 2009. Vol. 33. Issue 6. P. 445–450. DOI: 10.1016/j.compbiolchem.2009.10.002

18. Diaz A., Tomba E., Lennarson R., Richard R., Bagajewicz M., Harrison R.G. Prediction of protein solubility in Escherichia coli using logistic regression // Biotechnology and Bioengineering. 2010. Vol. 105. Issue 2. P. 374–383. htts://doi.org/10.1002/bit.22537.

19. Drury L. Transformation of bacteria by electroporation // Methods in Molecular Biology. 1996. Vol. 58. P. 249–256.

20. Gibson D.G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments // Methods in Enzymology. 2011. Vol. 498. P. 349–361. DOI: 10.1016/B978-0-12-385120-8.00015-2.

21. Yadav P., Yadav A., Garg V., Datta T.K., Goswami S.L., De S. A novel method of plasmid isolation using laundry detergent // Indian Journal of Experimental Biology. 2011. Vol. 49. Issue 7. P. 558–560.

22. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Analytical Biochemistry. 1976. Vol. 72. Issue 1-2. P. 248–254. http://dx.doi.org/10.1016/0003-2697(76)90527-3

23. Laemmli B.U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227. No. 5259. P. 680–685. DOI: 10.1038/227680a0

24. Yang C., Xu Y., Jia R., Li P., Zhang L., Wang M., Zhu D., Chen S., Liu M., Yin Z., Cheng A. Prokaryotic expression of a codon-optimized capsid gene from duck circovirus and its application to an indirect ELISA // Journal of Virological methods. 2017. Vol. 247. P. 1–5. DOI: 10.1016/j.jviromet.2017.05.003

25. Tanaka M., Tokuoka M., Gomi K. Effects of codon optimization on the mRNA levels of heterologous genes in filamentous fungi // Applied Microbiology and Biotechnology. 2014. Vol. 98. No. 9. P. 3859–3867. DOI: 10.1007/s00253-014-5609-7

26. Gustafsson C, Govindarajan S, Minshull J. Codon bias and heterologous protein expression // Trends in Biotechnolody. 2004. Vol. 22. Issue 7. P. 346–353. DOI: 10.1016/j.tibtech.2004.04.006

27. Murashima K., Kosugi A., Doi R.H. Solubilization of cellulosomal cellulases by fusion with cellulose‐binding domain of noncellulosomal cellulase engd from Clostridium cellulovorans // Proteins. 2003. Vol. 50. Issue 4. P. 620–628. DOI: 10.1002/prot.10298

28. Yuan H., Yang X., Hua Z.C. Optimization of expression of an annexin V-hirudin chimeric protein in Escherichia coli // Microbiological Research. 2004. Vol. 159. Issue 2. P. 147–156. DOI: 10.1016/j.micres. 2004.02.002

29. Costa S., Almeida A., Castro A., Domingues L. Fusion tags for protein solubility, purification and immunogenicity in Escherichia coli: the novel Fh8 system // Frontiers in Microbiology. 2014. Vol. 5. 20 p. DOI: 10.3389/fmicb.2014.00063


Для цитирования:


Гришин Д.В., Жданов Д.Д., Гладилина Ю.А., Покровская М.В., Александрова С.С., Соколов Н.Н. Гетерологическая экспрессия и характеристика нового мутантного ДНК-связывающего белка из гипертермофильного микроорганизма Thermotoga naphthophila. Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2019;9(2):288-301. https://doi.org/10.21285/2227-2925-2019-9-2-288-301

For citation:


Grishin D.V., Zhdanov D.D., Gladilina J.A., Pokrovskaya M.V., Aleksandrova S.S., Sokolov N.N. Heterogeneous expression and characterization of a new mutant DNA-binding protein from the Thermotoga naphthophila hyperthermophilic microorganism. Proceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology. 2019;9(2):288-301. (In Russ.) https://doi.org/10.21285/2227-2925-2019-9-2-288-301

Просмотров: 10


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 2227-2925 (Print)
ISSN 2500-1558 (Online)