vuzbiochemiИзвестия вузов. Прикладная химия и биотехнологияProceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology2227-29252500-1558ИРНИТУ10.21285/achb.975MVUYYRvuzbiochemi-1454Research ArticleФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯPHYSICOCHEMICAL BIOLOGYВлияние Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus на уровень эндогенного пероксида водорода и активность пероксидазы в трансгенных растениях картофеля (Solanum tuberosum L.), экспрессируюущих ген goxEffect of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus on endogenous hydrogen peroxide levels and peroxidase activity in transgenic potato plants (Solanum tuberosum L.) expressing the gox genehttps://orcid.org/0000-0002-0328-6716ФилиноваН. В.FilinovaN. V.

Филинова Надежда Владимировна, к.б.н., научный сотрудник

664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132

Nadezhda V. Filinova, Cand. Sci. (Biology), Researcher

132, Lermontov St., Irkutsk, 664033

filinova_nv@mail.ruhttps://orcid.org/0009-0003-4963-3917ИщенкоА. А.IshchenkoA. A.

Ищенко Алексей Александрович, к.б.н., младший научный сотрудник

664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132

Aleksei A. Ishchenko, Cand. Sci. (Biology), Researcher

132, Lermontov St., Irkutsk, 664033

aspt25@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3788-0895КопытинаТ. В.KopytinaT. V.

Копытина Татьяна Васильевна, к.б.н., старший научный сотрудник

664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132

Tatyana V. Kopytina, Cand. Sci. (Biology), Senior Researcher

132, Lermontov St., Irkutsk, 664033

kopytina@sifibr.irk.ruhttps://orcid.org/0000-0002-4582-8245МакароваЛ. Е.MakarovaL. E.

Макарова Людмила Евгеньевна, д.б.н., главный научный сотрудник

664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132

Liudmila E. Makarova, Dr. Sci. (Biology), Chief Researcher

132, Lermontov St., Irkutsk, 664033

makarova@sifibr.irk.ruФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАНРоссияSiberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry, Siberian Branch of the Russian Academy of SciencesRussian Federation202528052025152243251Copyright © Филинова Н.В., Ищенко А.А., Копытина Т.В., Макарова Л.Е., 20252025Филинова Н.В., Ищенко А.А., Копытина Т.В., Макарова Л.Е.Filinova N.V., Ishchenko A.A., Kopytina T.V., Makarova L.E.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vuzbiochemi.elpub.ru/jour/article/view/1454

Возрастание уровня пероксида водорода (H2O2) в растительных тканях способствует повышению устойчивости к разнообразным биотическим и абиотическим стрессорам. Одним из основных ферментов, участвующих в регуляции уровня H2O2 у растений, является пероксидаза. Цель данной работы заключалась в исследовании уровня эндогенного H2O2, активности пероксидазы и ее изоферментного спектра в корнях картофеля in vitro сорта Скарб и его трансгенных линий, экспрессирующих ген глюкозооксидазы (gox) из Penicillium funiculosum в нормальных условиях и при взаимодействии с фитопатогеном Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Показано, что уровень H2O2 трансгенных линий, несущих модифицированный ген gox, был существенно выше в сравнении с исходным сортом и еще более возрастал при воздействии фитопатогена. В нормальных условиях роста выявлены различия в спектре изоформ пероксидазы в трансгенных линиях и исходном сорте Скарб. При контакте с фитопатогеном существенно изменялся спектр изоформ в исходном сорте Скарб и в трансгенных линиях в сравнении с сортом Скарб. Полученные данные доказывают, что продукт экспрессии гена gox формирует высокий уровень H2O2 в результате окисления глюкозы. Высокий уровень H2O2 в трансгенных линиях, вероятно, инактивирует пероксидазу. Показано, что заражение растений фитопатогеном Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus приводит к увеличению активности пероксидазы и изменению изоферментного состава как в контроле, так и в трансгенных линиях.

Higher levels of hydrogen peroxide (H2O2) in plant tissues improve resistance to a variety of biotic and abiotic stressors. One of the key enzymes involved in the regulation of H2O2 levels in plants is peroxidase. The present study was aimed at analyzing the level of endogenous H2O2, peroxidase activity, and its isoenzyme spectrum in the roots of in vitro Skarb cultivar and its transgenic lines expressing the Penicillium funiculosum glucose oxidase (gox) gene under normal conditions and with exposure to the phytopathogen Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. The H2O2 level of transgenic lines carrying the modified gox gene was shown to be significantly higher compared to the original cultivar and to increase further due to exposure to the phytopathogen. Under normal growth conditions, differences were observed in the spectrum of peroxidase isoforms in the transgenic lines and the original Skarb cultivar. Upon exposure to the phytopathogen, the spectrum of isoforms was significantly altered in the original Skarb cultivar and in the transgenic lines compared with the Skarb cultivar. The obtained data prove that the product of gox gene expression causes a high H2O2 level due to glucose oxidation. High H2O2 levels in transgenic lines presumably inactivate peroxidase. Exposure to the phytopathogen Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus is shown to increase peroxidase activity and change the isoenzyme composition in both control and transgenic lines.

Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicusтрансгенные растения картофеляглюкозооксидазапероксид водородапероксидазаизоферментный спектрClavibacter michiganensis subsp. sepedonicustransgenic potato plantsglucose oxidasehydrogen peroxideperoxidaseisoenzyme spectrumИсследование выполнено в рамках государственного задания Федерального государственного бюджетного учреждения науки Сибирского института физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук (рег. № НИОКТР-125021902466-4).The study was carried out within the framework of the state assignment of the Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences (project no. 125021902466-4).ReferencesСавчин Д.В., Панюш А.С., Картель Н.А., Генетическая трансформация растений векторными конструкциями с геном GOX Penicillium funiculosum // Молекулярная и прикладная генетика. 2011. Т. 12. С. 49–55. EDN: ZYHRUD.Sauchyn D.V., Panyush A.S., Kartel N.A. Plant genetic transformation using vectors with Penicillium funiculosum gox gene. Molekulyarnaya i prikladnaya genetika. 2011;12:49-55. (In Russian). EDN: ZYHRUD.Савчин Д.В., Вересова Т.Н., Межнина О.А., Панюш А.С., Вячеслвова А.О., Голденкова-Павлова И.В. Оптимизация кодонового состава грибного гена gox Penicillium funiculosum для эффективной экспрессии в растениях Solanum tuberosum // Известия Национальной академии наук Беларуси. Серия биологических наук. 2015. N 1. С. 50–55. EDN: TKSWKP.Sauchyn D.V., Veresova T.N., Mezhnina O.A., Panush A.S., Vyacheslavova A.O., Goldenkova-Pavlova I.V. Codon optimization of the fungal Penicillium funiculosum gox gene for high-level expression in solanum tuberosum plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of Belarus. Biological Series. 2015;1:50-55. (In Russian). EDN: TKSWKP.Wu G., Shortt B.J., Lawrence E.B., Levine E.B., Fitzsimmons K.C., Shah D.M. Disease resistance conferred by expression of a gene encoding H2O2-generating glucose oxidase in transgenic potato plants // The Plant Cell. 1995. Vol. 7, no. 9. P. 1357–1368. DOI: 10.1105/tpc.7.9.1357.Wu G., Shortt B.J., Lawrence E.B., Levine E.B., Fitzsimmons K.C., Shah D.M. Disease resistance conferred by expression of a gene encoding H2O2-generating glucose oxidase in transgenic potato plants. The Plant Cell. 1995;7(9):1357-1368. DOI: 10.1105/tpc.7.9.1357.Jaspers P., Kangasjarvi J. Reactive oxygen species in abiotic stress signaling // Physiologia Plantarum. 2010. Vol. 138, no. 4. P. 405–413. DOI: 10.1111/j.1399-3054.2009.01321.x.Jaspers P., Kangasjarvi J. Reactive oxygen species in abiotic stress signaling. Physiologia Plantarum. 2010;138(4):405-413. DOI: 10.1111/j.1399-3054.2009.01321.x.Киргизова И.В., Гаджимурадов А.М., Омаров Р.Т. Особенности накопления антиоксидантных ферментов у картофеля в условиях биотического и абиотического стресса // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2018. Т. 8. N 4. С. 42–54. DOI: 10.21285/2227-2925-2018-8-4-42-54. EDN: YTDWDJ.Kirgizova I.V., Gajimuradova A.M., Omarov R.Т. Accumulation of antioxidant enzymes in potato plants under the conditions of biotic and abiotic stress. Proceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology. 2018;8(4):42-54. (In Russian). DOI: 10.21285/2227-2925-2018-8-4-42-54. EDN: YTDWDJ.Граскова И.А., Боровский Г.Б., Владимирова С.В., Романенко А.С., Войников В.К. Изоферментные спектры пероксидаз картофеля при патогенезе кольцевой гнили // Доклады Академии наук. 2002. Т. 384. N 6. С. 844–847. EDN: LCYKXD.Graskova I.A., Borovskii G.B., Vladimirova S.V., Romanenko A.S., Voinikov V.K. Isozyme spectra of potato peroxidases in ring rod pathogenesis. Doklady Akademii nauk. 2002;384(6):844-847. (In Russian). EDN: LCYKXD.Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Стационарная кинетика совместного окисления гидрохинонов и о-дианизидина перекисью водорода в присутствии пероксидазы хрена // Биохимия. 1999. Т. 64. N 2. С. 219–224.Rogozhin V.V., Verkhoturov V.V. Steady-state kinetics of combined oxidation of hydroquinone and o-dianisidine by hydrogen peroxide in the presence of horse radish peroxidase. Biokhimiya. 1999;64(2):219-224.Акимова Г.П., Верхотуров В.В, Соколова М.Г. Влияние Azotobacter на активность пероксидазы и содержание перекиси водорода в корнях проростков гороха, инокулированных Rhizobium // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2017. Т. 7. N 4. С. 126–131. DOI: 10.21285/2227-2925-2017-7-4-126-131. EDN: YMQFSN.Akimova G.P., Verkhoturov V.V., Sokolova M.G. The effect of Azotobacter on the activity of peroxidase and hydrogen peroxide content in the roots of pea seedlings inoculated with Rhizobium. Proceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology. 2017;7(4):126-131. (In Russian). DOI: 10.21285/2227-2925-2017-7-4-126-131. EDN: YMQFSN.Акимова Г.П., Соколова М.Г., Нечаева Л.В., Лузова Г.Б., Сидорова К.К. Роль пероксидазы во взаимодействиях растений гороха с Rhizobium // Агрохимия. 2002. N 12. С. 37–41.Akimova G.P., Sokolova M.G., Nechaeva L.V., Luzova G.B., Sidorova K.K. Role of peroxidase in pea plant interactions with Rhizobium. Agrokhimiya. 2002;12:37-41. (In Russian).Bradford M.M. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Analytical Biochemistry. 1976. Vol. 72. P. 248–254. DOI: 10.1016/0003-2697(76)90527-3.Bradford M.M. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 1976;72:248-254. DOI: 10.1016/0003-2697(76)90527-3.Попов В.Н., Антипина А.В., Астахова Н.В. Изме нения ультраструктуры хлоропластов растений табака в процессе защиты от окислительного стресса при гипотермии // Физиология растений. 2016. Т. 63. N 3. С. 319–326. DOI: 10.7868/S0015330316030118. EDN: VTQCER.Popov V.N., Antipina O.V., Astakhova N.V. Changes in chloroplast ultrastructure of tobacco plants in the course of protection from oxidative stress under hypothermia. Fiziologiya rastenii. 2016;63(3):319-326. (In Russian). DOI: 10.7868/S0015330316030118. EDN: VTQCER.Побежимова Т.П., Колесниченко А.В., Грабельных О.И. Методы изучения митохондрий растений. Полярография и электрофорез / отв. ред. Р.К. Саляев. М.: Изд-во ООО «НПК «ПРОМЭКОБЕЗОПАСНОСТЬ»», 2004. 98 с.Pobezhimova T.P., Kolesnichenko A.V., Grabel’nykh O.I. Methods of studying plant mitochondria. Polarography and electrophoresis. Moscow: OOO “NPK ‘PROMEKOBEZOPASNOST’’”; 2004, 98 p. (In Russian).Лойда З., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов: лабораторные методы / пер. с англ.; под ред. Н.Т. Райхлина. М.: Мир, 1982. 272 с.Lojda Z., Gossrau R., Sсhiebler T.H. Enzyme histochemistry: a laboratory manual; 1979, 339 p. (Russ. ed.: Gistokhimiya fermentov: laboratornye metody. Moscow: Mir; 1982, 272 p.).Еникеев А.Г., Копытина Т.В., Семенова Л.А., Натяганова А.В., Гаманец Л.В., Волкова О.Д. Агробактериальная трансформация как комплексный биотический стрессирующий фактор // Журнал стресс-физиологии и биохимии. 2008. Т. 4. N 1. С. 11–19. EDN: IUINPP.Enikeev A.G., Kopytina T.V., Semenova L.A., Natyaganova A.V., Gamanetz L.V., Volkova O.D. Agrobacterial transformation as complex biotical stressing factor. Journal of stress physiology & Biochemistry. 2008;4(1):11-19. (In Russian). EDN: IUINPP.Креславский В.Д., Лось Д.А., Аллахвердиев С.И., Кузнецов В.В. Сигнальная роль активных форм кислорода при стрессе у растений // Физиология растений. 2012. Т. 59. N 2. С. 163–178. EDN: OWEOSH.Kreslavski V.D., Allakhverdiev S.I., Los D.A., Kuznetsov V.V. Signaling role of reactive oxygen species in plants under stress. Fiziologiya rastenii. 2012;59(2):163-178. (In Russian). EDN: OWEOSH.Chen Z., Silva H., Klessig D.F. Active oxygen species in the induction of plant systemic acquired resistance by salicylic acid // Science. 1993. Vol. 262, no. 5141. P. 1883–1886. DOI: 10.1126/science.8266079.Chen Z., Silva H., Klessig D.F. Active oxygen species in the induction of plant systemic acquired resistance by salicylic acid. Science. 1993;262(5141):1883-1886. DOI: 10.1126/science.8266079.Pei Z.-M., Murata Y., Benning G., Thomine S., Klusener B., Allen G.J., et al. Calcium channels activated by hydrogen peroxide mediate abscisic acid signalling in guard cells // Nature. 2000. Vol. 406, no. 6797. P. 731–734. DOI: 10.1038/35021067.Pei Z.-M., Murata Y., Benning G., Thomine S., Klusener B., Allen G.J., et al. Calcium channels activated by hydrogen peroxide mediate abscisic acid signalling in guard cells. Nature. 2000;406(6797):731-734. DOI: 10.1038/35021067.Galvez-Valdivieso G., Mullineaux P.M. The role of reactive oxygen species in signalling from chloroplasts to the nucleus // Physiologia Plantarum. 2010. Vol. 138, no. 4. P. 430–439. DOI: 10.1111/j.1399-3054.2009.01331.x.Galvez-Valdivieso G., Mullineaux P.M. The role of reactive oxygen species in signalling from chloroplasts to the nucleus. Physiologia Plantarum. 2010;138(4):430-439. DOI: 10.1111/j.1399-3054.2009.01331.x.Pandey S., Fartyal D., Agarwal A., Shukla T., James D., Kaul T., et al. Abiotic stress tolerance in plants: myriad roles of ascorbate peroxidase // Frontiers in Plant Science. 2017. Vol. 8. P. 581. DOI: 10.3389/fpls.2017.00581.Pandey S., Fartyal D., Agarwal A., Shukla T., James D., Kaul T., et al. Abiotic stress tolerance in plants: myriad roles of ascorbate peroxidase. Frontiers in Plant Science. 2017;8:581. DOI: 10.3389/fpls.2017.00581.Андреева В.А. Фермент пероксидаза: участие в защитном механизме растений / отв. ред. Ю.Н. Журавлев. М.: Наука, 1988. 128 с.Andreeva V.A. Peroxidase: participation in the defense mechanism of plants. Moscow: Nauka; 1988, 128 p. (In Russian).Campo S., Manrique S., García-Martínez J., San Segundo B. Production of cecropin A in transgenic rice plants has an impact on host gene expression // Plant Biotechnology Journal. 2008. Vol. 6, no. 6. P. 585–608. DOI: 10.1111/j.1467-7652.2008.00339.x.Campo S., Manrique S., García-Martínez J., San Segundo B. Production of cecropin A in transgenic rice plants has an impact on host gene expression. Plant Biotechnology Journal. 2008;6(6):585-608. DOI: 10.1111/j.1467-7652.2008.00339.x.Arnao M.B., Acosta M., del Rio J.A., García-Cánovas F. Inactivation of peroxidase by hydrogen peroxide and its protection by a reductant agent // Biochimica et Biophysica Acta. 1990. Vol. 1038, no. 1. P. 85–89. DOI: 10.1016/0167-4838(90)90014-7.Arnao M.B., Acosta M., del Rio J.A., García-Cánovas F. Inactivation of peroxidase by hydrogen peroxide and its protection by a reductant agent. Biochimica et Biophysica Acta. 1990;1038(1):85-89. DOI: 10.1016/0167-4838(90)90014-7.Valderrama B., Ayala M., Vazquez-Duhalt R. Suicide inactivation of peroxidases review and the challenge of engineering more robust enzymes // Chemistry & Biology. 2002. Vol. 9, no. 5. P. 555–565. DOI: 10.1016/s1074-5521(02)00149-7.Valderrama B., Ayala M., Vazquez-Duhalt R. Suicide inactivation of peroxidases review and the challenge of engineering more robust enzymes. Chemistry & Biology. 2002;9(5):555-565. DOI: 10.1016/s1074-5521(02)00149-7.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.