vuzbiochemiИзвестия вузов. Прикладная химия и биотехнологияProceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology2227-29252500-1558ИРНИТУ10.21285/2227-2925-2019-9-2-277-287vuzbiochemi-200Research ArticleФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯPHYSICOCHEMICAL BIOLOGYМетодические рекомендации в использовании антител против дегидринов в агробиотехнологияхGuidelines for using antibodies against dehydrins in agrobiotechnologyБоровскийГ. Б.BorovskiiG. B.

д.б.н., профессор, заместитель директора по научной работе, 

г. Иркутск

Dr. Sci. (Biology), Professor, Vice-Director on Science,

Irkutsk

borovskii@sifibr.irk.ruИвановаМ. В.IvanovaM. V.

к.б.н., научный сотрудник,

г. Иркутск

Ph.D. (Biology), Researcher,

Irkutsk

omaria-84@yandex.ruКондаковаМ. А.KondakovaM. A.

к.б.н., ведущий инженер,

г. Иркутск

Ph.D. (Biology), Leading Engineer,

Irkutsk

kondakova-marina@mail.ruКоротаеваН. Е.KorotaevaN. E.

к.б.н., старший научный сотрудник,

г. Иркутск

Ph.D. (Biology), Senior Researcher,

Irkutsk

knev73@yandex.ruСувороваГ. Г.SuvorovaG. G.

д.б.н., ведущий научный сотрудник,

г. Иркутск

Dr. Sci. (Biology), Leading Researcher,

Irkutsk

galina.g.suvor@gmail.comУколоваИ. В.UkolovaI. V.

к.б.н., старший научный сотрудник,

г. Иркутск

Dr. Sci. (Biology), Leading Researcher,

Irkutsk

irina@sifibr.irk.ruФедяеваА. В.FedyaevaA. V.

к.б.н., научный сотрудник,

г. Иркутск

Ph.D. (Biology), Researcher,

Irkutsk

fedyaeva.anna@mail.ruСибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАНРоссияSiberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RASRussian Federation20192809201992277287Copyright © Боровский Г.Б., Иванова М.В., Кондакова М.А., Коротаева Н.Е., Суворова Г.Г., Уколова И.В., Федяева А.В., 20192019Боровский Г.Б., Иванова М.В., Кондакова М.А., Коротаева Н.Е., Суворова Г.Г., Уколова И.В., Федяева А.В.Borovskii G.B., Ivanova M.V., Kondakova M.A., Korotaeva N.E., Suvorova G.G., Ukolova I.V., Fedyaeva A.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vuzbiochemi.elpub.ru/jour/article/view/200

Детекция уровня экспрессии дегидринов в растениях становится распространенным приемом в тестировании устойчивости растений к холоду, засухе, засоленности почвы или высокому содержанию в ней ионов тяжелых металлов. Наиболее простым способом оценки содержания дегидринов является использование специфических антител, при этом специфичность антител является критическим моментом. На основании опыта определения дегидринов у различных растительных объектов авторами данной статьи была поставлена задача – сравнить реакции с антителами реакционноспособных белков, полученных из трех наиболее доступных источников, оценить их специфичность. Сопоставимость детектируемых антителами белков по количеству и молекулярной массе была исследована на нескольких растительных объектах: 1) суммарный и термостабильный белок хвои сосны обыкновенной, 2) белок митохондрий гороха; 3) суммарный и термостабильный белок озимой пшеницы; 4) суммарный и термостабильный белок арабидопсиса. Во всех случаях использования антител наблюдали либо слабые, либо существенные различия в количестве и молекулярной массе детектируемых групп белков. Эти различия можно объяснить тремя возможными причинами: вариабельность К-сегмента, разные белки-носители, используемые производителями, и наличие общих реакционноспособных эпитопов у некоторых групп белков, не являющихся дегидринами. При анализе различий в количестве детектируемых групп при использовании антител от разных производителей установлено, что они минимальны у злаковых растений и становятся больше у двудольных и хвойных, причем наибольшее количество детектируемых групп отмечено у митохондрий гороха. Часть связывающихся с антителами групп белков определенно не является дегидринами. Упомянутые различия меньше у термостабильных белков. Таким образом, получение термостабильной фракции белков можно рекомендовать в качестве простой процедуры, повышающей уверенность в детекции дегидринов. Использование сравнения количества дегидринов в качестве меры относительной устойчивости различных растений не следует применять при сравнении эволюционно далеких друг от друга видов, поскольку реакционноспособность антител к дегидринам далеких друг от друга видов может существенно отличаться. В то же время этот метод может быть рекомендован в агробиологии для оценки на молекулярном уровне исходной или индуцированной устойчивости сортов растений одного и того же вида, либо родственных видов к замерзанию, засухе и другим неблагоприятным условиям, связанным с дефицитом воды.

Detection of the expression levels of the dehydrin gene in plants is increasingly becoming a widespread technique for testing plant resistance to cold, drought, salinity or high heavy metal concentrations in soils. The simplest way to determine the content of dehydrins consists in using specific antibodies (antibody specificity is critical). The experience of dehydrin detection in various plants provided a basis for this work. In this study, we set out to compare the reactions of antibodies with reactive proteins derived from three most accessible sources, as well as to assess their specificity. The comparability of detected proteins in terms of their quantity and molecular weight was studied for several plants: 1) total and thermostable protein in scots pine needles; 2) mitochondrial protein in peas; 3) total and thermostable protein in winter wheat; 4) total and thermostable protein in arabidopsis. In all the cases, either slight or significant differences in the quantity and molecular weight of the detected protein groups were observed. These differences can be attributed to the three possible reasons: K-segment variability; different carrier proteins used by manufacturers; as well as the presence of shared reactive epitopes in some groups of proteins that are not dehydrins. The analysis of differences in the number of the groups detected using antibodies from different manufacturers reveals their amount to be minimal for cereal plants and becoming larger for dicotyledons and conifers. The largest number of the groups was detected in pea mitochondria. Some of the antibody-binding protein groups are definitely not dehydrins. The abovementioned differences are smaller for thermostable proteins. Thus, obtaining a thermostable protein fraction can be recommended as a simple procedure increasing the dehydrins detection level. The comparison of the dehydrin amounts should not be used as a measure of the relative plant resistance when comparing evolutionarily distant species, since the antibody reactivity to the dehydrins of distant species may differ significantly. At the same time, this method can be used in agrobiology for the molecular-level assessment of the initial or induced resistance of plant varieties (same or related species) to cold, drought, as well as other adverse conditions associated with water deficiency.

дегидриныустойчивость растенийвестерн-блоттингантителаdehydrinsplant resistancewestern blotantibodiesРабота выполнена при частичной финансовой поддержке РФФИ (проект N 18-54-00026).ReferencesGalau G.A., Hughes D.W., Dure L. Abscisic acid induction of cloned cotton late embryogenesisabundant (Lea) mRNAs // Plant Molecular Biology. 1986. Vol. 7. Issue 3. P. 155–170. DOI: https://doi.org/10.1007/BF00021327Galau G.A., Hughes D.W., Dure L. Abscisic acid induction of cloned cotton late embryogenesisabundant (Lea) mRNAs. Plant Molecular Biology. 1986, vol. 7, issue 3, pp. 155–170. DOI: https://doi.org/10.1007/BF00021327Thomashow M.F. Plant cold acclimation: Freezing Tolerance Genes and Regulatory Mechanisms // Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 1999. Vol. 50. P. 571–599. DOI: https://doi.org/10.1146/annurev.arplant.50.1.571.Thomashow M.F. Plant cold acclimation: Freezing Tolerance Genes and Regulatory Mechanisms. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 1999, vol. 50, pp. 571–599. DOI: https://doi.org/10.1146/annurev.arplant.50.1.571Close T.J. Dehydrins: A commonalty in the response of plants to dehydration and low temperature // Physiologia Plantarum. 1997. Vol. 100. P. 291–296. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.1997.tb04785.xClose T.J. Dehydrins: A commonalty in the response of plants to dehydration and low temperature. Physiologia Plantarum. 1997, vol. 100, pp. 291–296. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.1997.tb04785.xHanin M., Brini F.E., Ebel C., Toda Y., Takeda S., Masmoudi K. Plant dehydrins and stress tolerance: Versatile proteins for complex mechanisms // Plant Signaling & Behavior. 2011. Vol. 6. P. 1503–1509. DOI: https://doi.org/10.4161/psb.6. 10.17088Hanin M., Brini F.E., Ebel C., Toda Y., Takeda S., Masmoudi K. Plant dehydrins and stress tolerance: Versatile proteins for complex mechanisms. Plant Signaling & Behavior. 2011, vol. 6, pp. 1503–1509. DOI: https://doi.org/10.4161/psb. 6.10.17088Graether S.P., Boddington K.F. Disorder and function: a review of the dehydrin protein family // Front Plant Sci. 2014. Vol. 5. P. 1–12. DOI: https://doi.org/10.3389/fpls.2014.00576Graether S.P., Boddington K.F. Disorder and function: a review of the dehydrin protein family. Front Plant Sci. 2014, vol. 5, pp. 1–12. DOI: https://doi.org/10.3389/fpls.2014.00576Banerjee A., Roychoudhury A. Group II late embryogenesis abundant (LEA) proteins: structural and functional aspects in plant abiotic stress // Plant Growth Regulation. 2016. Vol. 79. Issue 1. P. 1–17. DOI: https://doi.org/10.1007/s10725-015-0113-3Banerjee A., Roychoudhury A. Group II late embryogenesis abundant (LEA) proteins: structural and functional aspects in plant abiotic stress. Plant Growth Regulation. 2016, vol. 79, issue 1, pp. 1–17. DOI: https://doi.org/10.1007/s10725-015-0113-3Vítámvás P., Kosová K., Musilová J., Holková L., Marík P., Smutná P., Klíma M., Prášil I.T. Relationship Between Dehydrin Accumulation and Winter Survival in Winter Wheat and Barley Grown in the Field // Frontiers in Plant Science. 2019. Vol.10. A. 7 DOI: 10.3389/fpls.2019.00007Vítámvás P., Kosová K., Musilová J., Holková L., Marík P., Smutná P., Klíma M., Prášil I.T. Relationship Between Dehydrin Accumulation and Winter Survival in Winter Wheat and Barley Grown in the Field. Frontiers in Plant Science. 2019, vol. 10, A. 7. DOI: 10.3389/fpls.2019.00007Боровский Г.Б., Ступникова И.В., Пешкова А.А., Дорофеев Н.В., Войников В.К. Термостабильные белки проростков и узлов кущения растений озимой пшеницы // Физиология растений. 1999. Т. 46. С. 777–783.Borovskii G.B., Stupnikova I.V., Peshkova A.A., Dorofeev N.V., Voinikov V.K. Thermostable proteins of seedlings and tillering nodes of winter wheat plants. Fiziologiya rastenii. 1999, vol. 46, pp. 777–783. (In Russian)Stupnikova I.V., Borovskii G.B., Dorofeev N.V., Peshkova A.A., Voinikov V.K. Accumulation and disappearance of dehydrins and sugars depending on freezing tolerance of winter wheat plants at different developmental phases // Journal of Thermal Biology. 2002. Vol. 27. P. 55–60. DOI: https://doi.org/10.1016/S0306-4565(01)00015-8Stupnikova I.V., Borovskii G.B., Dorofeev N.V., Peshkova A.A., Voinikov V.K. Accumulation and disappearance of dehydrins and sugars depending on freezing tolerance of winter wheat plants at different developmental phases. Journal of Thermal Biology. 2002, vol. 27, pp. 55–60. DOI: https://doi. org/10.1016/S0306-4565(01)00015-8Pomortsev А.V., Dorofeev N.V., Katysheva N.B., Peshkova А.А. Changes in dehydrin composition in winter cereal crowns during winter survival // Biologia Plantarum. 2017. Vol. 61. P. 394–398. DOI: 10.1007/s10535-016-0673-8Pomortsev А.V., Dorofeev N.V., Katysheva N.B., Peshkova А.А. Changes in dehydrin composition in winter cereal crowns during winter survival. Biologia Plantarum. 2017, vol. 61, pp. 394–398. DOI: 10.1007/s10535-016-0673-8Yu Zhengyang, Wang Xin, Zhang Linsheng Structural and Functional Dynamics of Dehydrins: A Plant Protector Protein under Abiotic Stress // Int. J. Mol. Sci. 2018. Vol. 19. No. 11. P. 3420. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms19113420Yu Zhengyang, Wang Xin, Zhang Linsheng Structural and Functional Dynamics of Dehydrins: A Plant Protector Protein under Abiotic Stress. Int. J. Mol. Sci. 2018, vol. 19, no. 11, pp. 3420. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms19113420Timmons T.M., Dunbar B.S. Protein blotting and immunodetection // Methods in Enzymology. 1990. Vol. 182. P. 679–688. DOI: https://doi.org/10.1016/0076-6879(90)82053-5Timmons T.M., Dunbar B.S. Protein blotting and immunodetection. Methods in Enzymology. 1990, vol. 182, pp. 679–688. DOI: https://doi.org/10.1016/0076-6879(90)82053-5Weiland G. The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)--a new serodiagnostic method for the detection of parasitic infections // Munchener medizinische Wochenschrift. 1978. Vol. 120. P. 1457–1460.Weiland G. The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)--a new serodiagnostic method for the detection of parasitic infections. Munchener medizinische Wochenschrift. 1978, vol. 120, pp. 1457–1460.Close T.J., Fenton R.D., Moonan F. A view of plant dehydrins using antibodies specific to the carboxyterminal peptide // Plant Molecular Biology. 1993. Vol. 23. P. 279–286. DOI: https://doi.org/10.1007/BF00029004.Close T.J., Fenton R.D., Moonan F. A view of plant dehydrins using antibodies specific to the carboxyterminal peptide. Plant Molecular Biology. 1993, vol. 23, pp. 279–286. DOI: https://doi.org/10.1007/BF00029004Korotaeva N.E., Oskorbina M.V., Kopytova L.D., Suvorova G.G., Borovskii G.B., Voinikov V.K. Variations in the content of stress proteins in the needles of common pine (Pinus sylvestris L.) within an annual cycle // Journal of Forest Research. 2012. Vol. 17. P. 89–7. DOI: https://doi.org/10.1007/s10310-011-0260-yKorotaeva N.E., Oskorbina M.V., Kopytova L.D., Suvorova G.G., Borovskii G.B., Voinikov V.K. Variations in the content of stress proteins in the needles of common pine (Pinus sylvestris L.) within an annual cycle. Journal of Forest Research. 2012, vol. 17, pp. 89–7. DOI: https://doi.org/10.1007/s10310-011-0260-yGrabel’nykh O.I., Pobezhimova T.P., Pavlovskaya N.S., Koroleva N.A., Borovik O.A., Lyubushkina I.V., Voinikov V.K. Antioxidant function of alternative oxidase in mitochondria of winter wheat during cold hardening // Biochemistry (Moscow) Supplement Series A: Membrane and Cell Biology. 2011. Vol. 5. No. 3. P. 249–257. DOI: 10.1134/S1990747811040040Grabel’nykh. O.I., Pobezhimova T.P., Pavlovskaya N.S., Koroleva N.A., Borovik O.A., Lyubushkina I.V., Voinikov V.K. Antioxidant function of alternative oxidase in mitochondria of winter wheat during cold hardening. Biochemistry (Moscow) Supplement Series A: Membrane and Cell Biology. 2011, vol. 5, no. 3, pp. 249–257. DOI: 10.1134/ S1990747811040040Bradford M.M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding // Analytical biochemistry. 1976. Vol. 72. P. 248–254. DOI: https://doi.org/10.1016/0003-2697(76)90527-3Bradford M.M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Analytical biochemistry. 1976, vol. 72, pp. 248–254. DOI: https://doi.org/10.1016/0003-2697(76)90527-3Jarvis S.B., Taylor M.A., Macleod M.R., Davies H.V. Cloning and Characterisation of the cDNA Clones of three Genes that are differentially Expressed during Dormancy-Breakage in the Seeds of Douglas Fir (Pseudotsuga menziesii) // Journal of Plant Physiology. 1996. Vol. 147. P. 559–566. DOI: https://doi.org/10.1016/S0176-1617(96)80046-0Jarvis S.B., Taylor M.A., Macleod M.R., Davies H.V. Cloning and Characterisation of the cDNA Clones of three Genes that are differentially Expressed during Dormancy-Breakage in the Seeds of Douglas Fir (Pseudotsuga menziesii). Journal of Plant Physiology. 1996, vol. 147, pp. 559–566. DOI: https://doi.org/10.1016/S0176-1617(96)80046-0

The authors declare that there are no conflicts of interest present.