vuzbiochemiИзвестия вузов. Прикладная химия и биотехнологияProceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology2227-29252500-1558ИРНИТУ10.21285/2227-2925-2019-9-3-519-528vuzbiochemi-223Research ArticleФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ И ОБЩАЯ БИОЛОГИЯPHYSICOCHEMICAL AND GENERAL BIOLOGYПринципы дифференциального центрифугирования сложных смесей липидов в градиенте полярностиPolarity gradient issues in differential centrifugation of complex lipid mixturesСаркисянВ. А.SarkisyanV. A.

к.б.н., старший научный сотрудник,

г. Москва

Ph.D. (Biology), Senior Researcher,

Moscow

sarkisyan.varuzhan@gmail.comФроловаЮ. В.FrolovaYu. V.

научный сотрудник,

г. Москва

Researcher,

Moscow

himic14@mail.ruШипелинВ. А.ShipelinV. A.

к.м.н., старший научный сотрудник, 

г. Москва

Ph.D. (Medicine), Senior Researcher,

Moscow

v.shipelin@yandex.ruКоденцоваВ. М.KodentsovaV. M.

д.б.н., профессор, ведущий научный сотрудник,

г. Москва

Dr. Sci. (Biology), Professor, Lead Researcher,

Moscow

kodentsova@ion.ruКочетковаА. А.KochetkovaA. A.

д.т.н., профессор, заведующая лабораторией,

г. Москва

Dr. Sci. (Engineering), Professor, Head of the Laboratory,

Moscow

kochetkova@ion.ruФедеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищиРоссияFederal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food SafetyRussian Federation20190810201993519528Copyright © Саркисян В.А., Фролова Ю.В., Шипелин В.А., Коденцова В.М., Кочеткова А.А., 20192019Саркисян В.А., Фролова Ю.В., Шипелин В.А., Коденцова В.М., Кочеткова А.А.Sarkisyan V.A., Frolova Y.V., Shipelin V.A., Kodentsova V.M., Kochetkova A.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vuzbiochemi.elpub.ru/jour/article/view/223

Фосфолипиды являются одним из важнейших классов природных регуляторов физиологических процессов, в связи с чем поиск способов их аналитического и препаративного разделения представляет значительный интерес. Целью данного исследования являлась разработка принципов дифференциального центрифугирования сложных смесей липидов на примере фосфолипидов. В работе были использованы расчетные методы оценки параметров растворимости Хансена для фосфолипидов, а также инструментальные методы исследования, в том числе: тензометрия (измерение плотности), динамическое лазерное светорассеяние (оценка размера частиц), ИК-спектроскопия с преобразованиями Фурье. Данные методы были применены к образцам фосфолипидов, выделенных из головного мозга телят. Охарактеризовано сродство изучаемых фосфолипидов к отдельным слоям растворителей. В результате проведенных работ была предложена математическая модель процесса дифференциального центрифугирования сложных смесей фосфолипидов в градиенте полярности растворителя на основе уравнений Нэрнста – Бруннэра и основного уравнения центрифугирования. Установлены оптимальные параметры процесса центрифугирования (1500 об./мин в течение 15 мин при температуре 2–4 °С). В результате анализа ИК-спектров были выявлены существенные отличия между веществами на каждом слое растворителя, обусловленные разделением классов фосфолипидов между слоями растворителей. Отмечено, что для повышения эффективности разделения сложных смесей фосфолипидов необходим дальнейший поиск новых комбинаций растворителей, способствующих более специфичному разделению смеси. Также актуальными для дальнейших исследований являются модификация объема слоев растворителей и определение его соотношения с объемом введенной суспензии. Учитывая аппаратурную простоту и низкую стоимость разработанного метода, его можно легко масштабировать на промышленные условия получения биологически активных веществ для включения их в состав пищевых продуктов.

Since phospholipids are one of the most important classes of natural regulators of physiological processes, the search for methods allowing their analytical and preparative separation is of considerable interest. The aim of this study is to reveal principles underlying the differential centrifugation of complex lipid mixtures on the example of phospholipids. The current study uses calculation methods for estimating the Hansen solubility parameters for phospholipids, as well as instrumental research methods comprising tensometry (density measurement), dynamic laser light scattering (particle size evaluation) and IR spectroscopy with Fourier transformation. These methods were applied to samples of phospholipids isolated from calf brain tissue. The affinity of the studied phospholipids to individual solvent layers was characterised. As a result of the work performed, a mathematical model of the process of differential centrifugation of phospholipid complex mixtures in the gradient of solvent polarity is proposed on the basis of the Nernst-Brunner equations and main centrifugation equation. The established optimal parameters of the centrifugation process comprise 1500 rpm for 15 minutes at a temperature of 2–4 °С. IR spectral analysis revealed significant differences between the substances of each solvent layer, which are due to the separation of the phospholipid classes between the layers of solvents. The necessity for further research into new combinations of solvents contributing to a more specific separation of the mixture and aimed at increasing the separation efficiency of phospholipid complex mixtures, is justified. The volume modification of solvent layers and determination of its ratio with the volume of the introduced suspension also appear to be relevant further research directions. Given the simplicity and low cost of the hardware, the developed method can be easily scaled to industrial conditions for the production of biologically active substances for inclusion in food products.

фосфолипидыдифференциальное центрифугированиеградиент полярностипараметры Хансенаphospholipidsdifferential centrifugationpolarity gradientHansen parametersИсследование выполнено за счет средств гранта Российского научного фонда (проект № 14-16-00055).ReferencesOrešič M., Hänninen V. A., Vidal-Puig A. Lipidomics: a new window to biomedical frontiers // Trends in biotechnology. 2008. Vol. 26. Issue 12. P. 647–652. DOI: 10.1016/j.tibtech.2008.09.001Orešič M., Hänninen V. A., Vidal-Puig A. Lipidomics: a new window to biomedical frontiers. Trends in biotechnology. 2008, vol. 26, issue 12, pp. 647–652. DOI: 10.1016/j.tibtech.2008.09.001Pietiläinen K.H., Róg T., Seppänen-Laakso T., Virtue S., Gopalacharyulu P., Tang J., RodriguezCuenca S., Maciejewski A., Naukkarinen J., Ruskeepää A.L., Niemelä P.S., Yetukuri L., Tan C.Y., Velagapudi V., Castillo S., Nygren H., Hyötyläinen T., Rissanen A., Kaprio J., Yki-Järvinen H., Vattulainen I., Vidal-Puig A., Orešič M. Association of lipidome remodeling in the adipocyte membrane with acquired obesity in humans // PLoS biology. 2011. Vol. 9. No. 6. P. e1000623. DOI: 10.1371/journal.pbio.1000623Pietiläinen K.H., Róg T., Seppänen-Laakso T., Virtue S., Gopalacharyulu P., Tang J., RodriguezCuenca S., Maciejewski A., Naukkarinen J., Ruskeepää A.L., Niemelä P.S., Yetukuri L., Tan C.Y., Velagapudi V., Castillo S., Nygren H., Hyötyläinen T., Rissanen A., Kaprio J., Yki-Järvinen H., Vattulainen I., Vidal-Puig A., Orešič M. Association of lipidome remodeling in the adipocyte membrane with acquired obesity in humans. PLoS biology. 2011, vol. 9, no. 6, pp. e1000623. DOI: 10.1371/journal.pbio.1000623Kaddurah-Daouk R., McEvoy J., Baillie R.A., Lee D., Yao J.K., Doraiswamy P.M., Krishnan K.R.R. Metabolomic mapping of atypical antipsychotic effects in schizophrenia // Molecular psychiatry. 2007. Vol. 12. No. 10. P. 934–945.Kaddurah-Daouk R., McEvoy J., Baillie R.A., Lee D., Yao J.K., Doraiswamy P.M., Krishnan K.R.R. Metabolomic mapping of atypical antipsychotic effects in schizophrenia. Molecular psychiatry. 2007, vol. 12, no. 10, pp. 934–945.Han X., Holtzman D.M., McKeel Jr D.W. Plasmalogen deficiency in early Alzheimer's disease subjects and in animal models: molecular characterization using electrospray ionization mass spectrometry // Journal of neurochemistry. 2001. Vol. 77. No. 4. P. 1168–1180. DOI: 10.1046/j.1471-4159.2001.00332.xHan X., Holtzman D.M., McKeel Jr D.W. Plasmalogen deficiency in early Alzheimer's disease subjects and in animal models: molecular characterization using electrospray ionization mass spectrometry. Journal of neurochemistry. 2001, vol. 77, no. 4. pp. 1168–1180. DOI: 10.1046/j.1471-4159.2001.00332.xHaughey N.J., Steiner J., Nath A., McArthur, Sacktor N., Pardo C., Bandaru V.V.R. Converging roles for sphingolipids and cell stress in the progression of neurological dysfunction in AIDS // Frontiers in bioscience: a journal and virtual library. 2008. Vol. 13. P. 5120–5130.Haughey N.J., Steiner J., Nath A., McArthur, Sacktor N., Pardo C., Bandaru V.V.R. Converging roles for sphingolipids and cell stress in the progression of neurological dysfunction in AIDS. Frontiers in bioscience: a journal and virtual library. 2008, vol. 13, pp. 5120–5130.Angelini R., Vitale R., Patil V.A., Cocco T., Ludwig B., Greenberg M.L., Corcelli A. Lipidomics of intact mitochondria by MALDI-TOF/MS // Journal of lipid research. 2012. Vol. 53. No. 7. P. 1417–1425.Angelini R., Vitale R., Patil V.A., Cocco T., Ludwig B., Greenberg M.L., Corcelli A. Lipidomics of intact mitochondria by MALDI-TOF/MS. Journal of lipid research. 2012, vol. 53, no. 7, pp. 1417–1425.Акмурзина В.А., Селищева А.А., Швец В.И. От анализа липидов к липидомике // Тонкие химические технологии. 2012. T. 7. N 6. C. 3–21.Akmurzina V.A., Selishcheva A.A., Shvets V.I. From lipid analysis to lipidomics. Tonkie khimicheskie tekhnologii. 2012, vol. 7, no. 6, pp. 3–21. (In Russian)Wang T., Zhou D. Advances in phospholipid quantification methods // Current Opinion in Food Science.2017. Vol. 16. P. 15–20. DOI: 10.1016/j.cofs.2017.06.007Wang T., Zhou D. Advances in phospholipid quantification methods. Current Opinion in Food Science. 2017, vol. 16, pp. 15–20. DOI: 10.1016/j.cofs.2017.06.007Brasaemle D.L., Wolins N.E. Isolation of lipid droplets from cells by density gradient centrifugation // Current protocols in cell biology. 2016. Vol. 72. No. 1. P. 3–15. DOI: 10.1002/cpcb.10Brasaemle D.L., Wolins N.E. Isolation of lipid droplets from cells by density gradient centrifugation. Current protocols in cell biology. 2016, vol. 72, no. 1, pp. 3–15. DOI: 10.1002/cpcb.10Hara A., Radin N.S. Lipid extraction of tissues with a low-toxicity solvent // Analytical Biochemistry. 1978. Vol. 90. No. 1. P. 420–426. DOI: 10.1016/0003-2697(78)90046-5Hara A., Radin N.S. Lipid extraction of tissues with a low-toxicity solvent. Analytical Biochemistry. 1978, vol. 90, no. 1, pp. 420–426. DOI: 10.1016/0003-2697(78)90046-5Stetefeld J., McKenna S.A., Patel T.R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences // Biophysical Reviews. 2016. Vol. 8. P. 409–427. DOI: 10.1007/s12551-016-0218-6Stetefeld J., McKenna S.A., Patel T.R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 2016, vol. 8, pp. 409–427. DOI: 10.1007/s12551-016-0218-6Siepmann J., Siepmann F. Mathematical modeling of drug dissolution // International journal of pharmaceutics. 2013. Vol. 453. No. 1. P. 12–24.Siepmann J., Siepmann F. Mathematical modeling of drug dissolution. International journal of pharmaceutics. 2013, vol. 453, no. 1, pp. 12–24.Seager R.J., Acevedo A.J., Spill F., Zaman M.H. Solid dissolution in a fluid solvent is characterized by the interplay of surface area-dependent diffusion and physical fragmentation // Scientific reports. 2018. Vol. 8. No. 1. P. 7711.Seager R.J., Acevedo A.J., Spill F., Zaman M.H. Solid dissolution in a fluid solvent is characterized by the interplay of surface area-dependent diffusion and physical fragmentation. Scientific reports. 2018, vol. 8, no. 1, pp. 7711.Boger E., Wigström O. A Partial Differential Equation Approach to Inhalation Physiologically Based Pharmacokinetic Modeling // CPT: Pharmacometrics Systems Pharmacology. 2018. Vol. 7. No. 10. P. 638–646. DOI:10.1002/psp4.12344Boger E., Wigström O. A Partial Differential Equation Approach to Inhalation Physiologically Based Pharmacokinetic Modeling. CPT: Pharmacometrics Systems Pharmacology. 2018, vol. 7, no. 10, pp. 638–646. DOI:10.1002/psp4.12344Livshits M.A., Khomyakova E., Evtushenko E.G., Lazarev V.N., Kulemin N.A., Semina S.E., Generozov E.V., Govorun V.M. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol // Scientific Reports. 2015. Vol. 5. P. 17319. DOI: 10.1038/srep17319Livshits M.A., Khomyakova E., Evtushenko E.G., Lazarev V.N., Kulemin N.A., Semina S.E., Generozov E.V., Govorun V.M. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Scientific Reports. 2015, vol. 5, pp. 17319. DOI: 10.1038/srep17319Van Krevelen D.W., Te Nijenhuis K. Properties of polymers: their correlation with chemical structure; their numerical estimation and prediction from additive group contributions. Elsevier, 2009. 1004 p.Van Krevelen D.W., Te Nijenhuis K. Properties of polymers: their correlation with chemical structure; their numerical estimation and prediction from additive group contributions. Elsevier, 2009, 1004 p.Hansen C.M. Hansen solubility parameters: a user´s handbook. 2nd ed. CRC Press, 2007. 544 p.Hansen C.M. Hansen solubility parameters: a user´s handbook. 2nd ed. CRC Press, 2007, 544 p.Verheyen S., Augustijns P., Kinget R., Van den Mooter G. Determination of partial solubility parameters of five benzodiazepines in individual solvents // International journal of pharmaceutics. 2001. Vol. 228. No. 1-2. P. 199–207.Verheyen S., Augustijns P., Kinget R., Van den Mooter G. Determination of partial solubility parameters of five benzodiazepines in individual solvents. International journal of pharmaceutics. 2001, vol. 228, no. 1-2, pp. 199–207.Folch J., Lees M., Sloane Stanley G.H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues // J Biol Chem. 1957. Vol. 226. No 1. P. 497–509.Folch J., Lees M., Sloane Stanley G.H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 1957, vol. 226, no 1, pp. 497–509.Dreissig I., Machill S., Salzer R., Krafft C. Quantification of brain lipids by FTIR spectroscopy and partial least squares regression // Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 2009. Vol. 71. No. 5. P. 2069–2075. DOI: 10.1016/j.saa.2008.08.008Dreissig I., Machill S., Salzer R., Krafft C. Quantification of brain lipids by FTIR spectroscopy and partial least squares regression. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 2009, vol. 71, no. 5, pp. 2069–2075. DOI: 10.1016/j.saa.2008.08.008

The authors declare that there are no conflicts of interest present.