vuzbiochemiИзвестия вузов. Прикладная химия и биотехнологияProceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology2227-29252500-1558ИРНИТУ10.21285/2227-2925-2019-9-4-712-721vuzbiochemi-265Research ArticleФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯPHYSICOCHEMICAL BIOLOGYКлональное микроразмножение и сохранение в условиях in vitro двух сортов хурмы восточной (Diospyros kaki thunb.)In vitro cloned micropropagation and conservation for two cultivars of Diospyros kaki (Diospyros kaki Thunb.)МитрофановаИ. В.MitrofanovaI. V.

Митрофанова Ирина Вячеславовна, д.б.н., главный научный сотрудник, заведующая отделом биологии развития растений, биотехнологии и биобезопасности

298648, г. Ялта, ул. Никитский спуск, 52, Республика Крым

Irina V. Mitrofanova, Dr. Sci. (Biology), Chief Researcher, Head of Plant Developmental Biology, Biotechnology and Biosafety Department

52, Nikitskiy spusk, Yalta 298648, The Republic of the Crimea

irimitrofanova@yandex.ruИвановаН. Н.IvanovaN. N.

Иванова Наталия Николаевна, к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории биотехнологии и вирусологиии растений

298648, г. Ялта, ул. Никитский спуск, 52, Республика Крым

Natalya N. Ivanova, Cand. Sci. (Biology), Senior Researcher, Plant Biotechnology and Virology Laboratory

52, Nikitskiy spusk, Yalta 298648, The Republic of the Crimea

nnivanova2017@yandex.ruКузьминаТ. Н.KuzminaT. N.

Кузьмина Татьяна Николаевна, к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории биохимии, физиологии и репродуктивной биологии растений

298648, г. Ялта, ул. Никитский спуск, 52, Республика Крым

Tatyana N. Kuzmina, Cand. Sci. (Biology), Senior Researcher, Plant Biochemistry, Physiology and Reproductive Biology Laboratory

52, Nikitskiy spusk, Yalta 298648, The Republic of the Crimea

tnkuzmina@rambler.ruХохловС. Ю.KhokhlovS. Yu.

Хохлов Сергей Юрьевич, к.с.-х.н., заведующий лабораторией южных плодовых и орехоплодных культур

298648, г. Ялта, ул. Никитский спуск, 52, Республика Крым

Sergey Yu. Khokhlov, Cand. Sci. (Agriculture), Head of South Fruit and Nut Cultures

52, Nikitskiy spusk, Yalta 298648, The Republic of the Crimea

ocean-10@mail.ruОрдена Трудового Красного Знамени Никитский ботанический cад – Национальный научный центр РАНРоссияThe Labor Red Banner Order Nikitsky Botanical Gardens – National Scientific Center of the RASRussian Federation20190501202094712721Copyright © Митрофанова И.В., Иванова Н.Н., Кузьмина Т.Н., Хохлов С.Ю., 20202020Митрофанова И.В., Иванова Н.Н., Кузьмина Т.Н., Хохлов С.Ю.Mitrofanova I.V., Ivanova N.N., Kuzmina T.N., Khokhlov S.Y.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vuzbiochemi.elpub.ru/jour/article/view/265

Цель исследования – усовершенствование способа регенерации микропобегов хурмы восточной сортов Сувенир Осени и Южная Красавица селекции Никитского ботанического сада и оптимизация условий для беспересадочного 12-месячного депонирования хурмы восточной в условиях in vitro с целью дальнейшего создания генобанка ценных субтропических сельскохозяйственных культур. Исследования по введению эксплантов в культуру in vitro и регенерации микропобегов хурмы проводили в лаборатории биотехнологии и вирусологии растений ФГБУН Ордена Трудового Красного Знамени «Никитский ботанический сад» – Национальный научный центр РАН. Для регенерации микропобегов использовали среду Мурасиге и Скуга (МС) с регуляторами роста – 6-бензилапинопурин (БАП) и 3-(1,2,3-тиадиазолин-5)-1-фенилмочевина (ТДЗ). Для сохранения in vitro сегменты микропобегов помещали на питательную среду ¼ нормы МС, дополненную сахарозой и хлорхолинхлоридом (ССС). Культуральные сосуды помещали в холодильные камеры с низкой положительной температурой (4–14 °С). В ходе экспериментов установлена индуцирующая роль БАП (2–4 мг/л) в питательной среде МС на этапе индукции побегообразования, что обеспечивало стабильную прямую регенерацию микропобегов из вегетативных почек хурмы восточной. Максимальное число нормальных микропобегов без видимых изменений получено на среде МС, дополненной 4 мг/л БАП: 2,0±0,4 шт. – у сорта Сувенир Осени, 2,7±0,4 шт. – у сорта Южная Красавица. Средняя длина микропобегов достигала 1,90±0,04 см для сорта Сувенир Осени и 3,1±0,07 см – для сорта Южная Красавица. Наличие в среде МС ТДЗ способствовало формированию микропобегов путем непрямого органогенеза в культуре высечек листа исследуемых сортов. Частота побегообразования из высечек листа достигала 65–79 % через 6 недель культивирования на средах с 1,1 и 1,7 мг/л ТДЗ. Различия морфогенетического потенциала эксплантов прослеживались на протяжении всех этапов развития. Данные гистологических исследований каллуса подтверждают наличие пролиферативно активных клеток, которые дают начало меристемам микропобегов. Показана стабилизирующая роль 60,0 г/л сахарозы и 0,2–0,4 г/л ССС в среде ¼ МС при температуре сохранения 8–10 °С на жизнеспособность эксплантов хурмы в течение 12 месяцев.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The study is aimed at improving the microsprout regeneration method for the 'Suvenir Oseni' and 'Yuzhnaya Krasavitsa' Diospyros kaki (persimmon) cultivars of the Nikitsky Botanical Gardens. The breeding of and optimising the conditions for non-stop 12-month in vitro deposition of kaki persimmon was carried out for the purpose of creating a gene bank of valuable subtropical crops. The explanting of in vitro culture and the regeneration of persimmon microsprouts was carried out in the laboratory of plant biotechnology and virology of the "Nikitsky Botanical Gardens" National Scientific Centre RAS. For regeneration of microsprouts, Murashige and Skoog medium (MSO) containing 6-benzylapinopurin (BAP) and 3-(1,2,3-Thiadiazolin-5)- 1-phenylurea (TDZ) growth regulators was used. In order to ensure in vitro preservation, microsprout segments were placed in a nutrient medium composed by ¼ of normal MS, sucrose and chlorocholinchloride (CCC). The culture vessels were placed in refrigerators to maintain a low positive temperature (4–14 °С). In the course of the experiments, the inducing role of BAP (2–4 mg/L) in the MS nutrient medium at the induction stage of spout formation was established to ensure stable direct regeneration of microsprouts from the vegetative burgeons of kaki persimmon. The maximum number of normal microsprouts having no visible changes was obtained in MS medium having a BAP concentration of 4 mg/L and equal to 2.0±0.4 and 2.7±0.4 pcs. for the 'Suvenir Oseni' and 'Yuzhnaya Krasavitsa' cultivars, respectively. The average length of microsprouts reached 1.90±0.04 cm for the 'Suvenir Oseni' cultivar, while, for 'Yuzhnaya Krasavitsa', this value was equal to 3.1±0.07 cm. The presence of TDZ in the MS medium facilitated the formation of microsprouts through indirect organogenesis in the leaf cutting culture of the studied cultivars. The frequency of spout formation from leaf cuttings reached 65–79 % following 6 weeks of cultivation on media with 1.1 and 1.7 mg/L concentration of TDZ. Differences in the morphogenetic potential of explants were traced throughout all stages of development. Data from histological callus studies confirm the presence of proliferatively active cells giving rise to microsprout meristems. The concentration of 60.0 g/L and 0.2–0.4 g/L for sucrose and CCC, respectively, contained in ¼ MS medium was shown to stabilise the viability of persimmon explants at a storage temperature of 8–10 °С for 12 months.

Diospyros kakiмикроразмножениеin vitroорганогенездепонированиеDiospyros kakimicropropagationin vitroorganogenesisdepositionРабота была выполнена в рамках Госзадания № 0829-2019-0038 ФГБУН «Никитский ботанический cад – Национальный научный центр РАН».The study was carried out as a part of the State assignment no. 0829-2019-0038 for Nikitsky Botanical Gardens – National Scientific Center of the RAS.ReferencesХохлов С.Ю. Оценка сортов хурмы в коллекции Никитского сада // Сборник научных трудов ГНБС. 2015. Т. 140. С. 206–221.Khokhlov SYu. Assessment of persimmon varieties in the Nikitsky Garden collection. Sbornik nauchnykh trudov GNBS. 2015;140:206–221. (In Russian)Yonemori K., Sugiura A., Yamada M. Persimmon genetics and breeding // Plant breeding reviews. 2000. Vol. 19. Р. 191–225.Yonemori K, Sugiura A, Yamada M. Persimmon genetics and breeding. Plant breeding reviews. 2000;19:191–225.Bhojwani S.S., Dantu P.K. Plant Tissue Culture: An Introductory Text. (New Delhi, Heidelberg, New York, Dordrecht, London: Springer), 2013, 309 р. https://doi.org/10.1007/978-81-322-1026-9.Bhojwani SS, Dantu PK. Plant Tissue Culture: An Introductory Text. New Delhi, Heidelberg, New York, Dordrecht, London: Springer; 2013, 309 р. https://doi.org/10.1007/978-81-322-1026-9Иванова Н.Н., Митрофанова И.В., Браилко В.А., Кузьмина Т.Н., Хохлов С.Ю. Биотехнологические приемы размножения хурмы восточной // Экосистемы. 2017. Вып. 11 (41). С. 60–67.Ivanova NN, Mitrofanova IV, Brailko VA, Kuzmina TN, Khokhlov SYu. Biotechnological methods of the Persimmon propagation. Ekosistemy = Ecosystem. 2017;11:60–67. (In Russian)Kochanova Z., Onus N., Brindsa J. Adventitious shoot regeneration from dormant duds of persimmon (Diospyros kaki Thunb.) cv. Hachiya // Journal of Agrobiology. 2011. Vol. 28. N 2. P. 113– 118. https://doi.org/10.2478/v10146-011-0012-9Kochanova Z, Onus N, Brindsa J. Adventitious shoot regeneration from dormant duds of persimmon (Diospyros kaki Thunb.) cv. Hachiya. Journal of Agrobiology. 2011;28(2):113–118. https://doi.org/10.2478/v10146-011-0012-9Liu Y., Ma J., Tang X., Song C. Study on the adventitious shoot regeneration of persimmon leaves // Hubei Agri Sciences. 2006. Vol. 45. P. 618–621.Liu Y, Ma J, Tang X, Song C. Study on the adventitious shoot regeneration of persimmon leaves. Hubei Agri Sciences. 2006;45:618–621.Иванова Н.Н., Митрофанова И.В., Хохлов С.Ю. Особенности введения эксплантов хурмы восточной в условия in vitro // Бюллетень ГНБС. 2016. N 119. С. 45–51.Ivanova NN, Mitrofanova IV, Khokhlov SYu. Features of the introduction of east persimmon explants in vitro. Byulleten' GNBS. = Bulletin of State Nikitsky Botanical Garden. 2016;119:45–51. (In Russian)Иванова Н.Н., Митрофанова И.В., Хохлов С.Ю. Различные пути регенерации растений Diospyros kaki Thunb. сорта Золотистая в условиях in vitro // Бюллетень ГНБС. 2016. Вып. 120. С. 24–30.Ivanova NN, Mitrofanova IV, Khokhlov SYu. Various regeneration ways of Diospyros kaki Thunb. cultivar “Zolotystaya” in vitro. Byulleten' GNBS. = Bulletin of State Nikitsky Botanical Garden. 2016;120:24–30. (In Russian)Плаксина Т.В., Пищева Г.Н. Биотехнология в селекции, размножении и сохранении растений // Бюллетень Ботанического сада-института ДВО РАН. 2014. Вып. 12. С. 22–30.Plaksina TV, Pishcheva GN. Biotechnology in plant breeding, reproduction and conservation. Byulleten' Botanicheskogo cada-instituta DVO RAN. = Bulletin of Botanical Garden-Institute FEB RAS. 2014;12:22–30. (In Russian)Molkanova O., Egorova D., Mitrofanova I. Preservation Characteristics of Valuable Plant Species in In Vitro Genebanks at Russian Botanical Gardens // In Vitro Cellular and Developmental Biology – Plant. 2018. Vol. 58. Suppl. 1. P. 46. https://doi.org/10.1007/s11627-018-9927-9Molkanova O, Egorova D, Mitrofanova I. Preservation Characteristics of Valuable Plant Species in In Vitro Genebanks at Russian Botanical Gardens. In Vitro Cellular and Developmental Biology – Plant. 2018;58(1):46. https://doi.org/10. 1007/s11627-018-9927-9Новикова Т.И., Набиева А.Ю., Полубоярова Т.В. Сохранение редких и полезных растений в коллекции Центрального cибирского ботанического сада // Вестник ВОГиС. 2008. Т. 12. N 4. С. 564–572.Novikova TI, Nabieva AYu, Poluboyarova TV. Preservation of rare and useful plants in the collection of the Central Siberian Botanical Garden. Informatsionnyi Vestnik VOGiS. = Information Bulletin of Vavilov State Institute of Genetics and Breeding. 2008;12(4):564–572. (In Russian)Molkanova O., Shirnina I., Mitrofanova I. Conservation and micropropagation of rare and endemic species in genpool collection of the Russian Federation // Journal of Biotechnology. 2018. Vol. 280. P. S83–S84. https://doi.org/10.1016/j. biotec.2018.06.274Molkanova O, Shirnina I, Mitrofanova I. Conservation and micropropagation of rare and endemic species in genpool collection of the Russian Federation. Journal of Biotechnology. 2018;280: S83–S84. https://doi.org/10.1016/j.biotec.2018.06.274Sarasan W., Cripps G., Ramsay M., Atherton C., McMichen M., Prendergast G., et al. Conservation in vitro of threatened plants – progress in the past decade // In Vitro Cellular & Developmental Biology – Plant. 2006. Vol. 42. N 3. Р. 206–214. https://doi.org/10.1079/IVP2006769Sarasan W, Cripps G, Ramsay M, Atherton C, McMichen M, Prendergast G, et al. Conservation in vitro of threatened plants – progress in the past decade. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Plant. 2006;42(3):206–214. https://doi.org/10.1079/IVP2006769Митрофанова И.В. Соматический эмбриогенез и органогенез как основа биотехнологии получения и сохранения многолетних садовых культур: монография. Киев: Аграрна наука, 2011. 344 с.Mitrofanova IV. Somatic embryogenesis and organogenesis as the basis of biotechnology for obtaining and preserving perennial garden crops. Kiev: Agrarna nauka; 2011. 344 p. (In Russian)Engelmann F. Use of biotechnologies for the conservation of plant biodiversity // In Vitro Cellular and Development Biology – Plant. 2011. Vol. 47. N 1. P. 5–16 https://doi.org/10.1007/s1 1627-010-9327-2Engelmann F. Use of biotechnologies for the conservation of plant biodiversity. In Vitro Cellular and Development Biology – Plant. 2011;47(1):5–16 https://doi.org/10.1007/s11627-010-9327-2Kyte L., Kleyn J., Scoggins H., Bridgen M. Plants from test tubes: An introduction of micropropagation. 4th ed. Portland, Oregon: Timber Press, 2013. 274 p.Kyte L, Kleyn J, Scoggins H, Bridgen M. Plants from test tubes: An introduction of micropropagation. 4th ed. Portland, Oregon: Timber Press; 2013. 274 p.Murashige T, Skoog F. А revised medium for rapid growth and bioassays with Tobacco tissue cultures // Physiologia Plantarum. 1962. Vol. 15. Issue 3. P. 473–497. https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.xMurashige T Skoog F. А revised medium for rapid growth and bioassays with Tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 1962;15(3): 473–497. https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.19 62.tb08052.xКузьмина Т.Н. Генезис микроспорангия Jasminum officinale L. (Oleaceae) // Бюллетень ГНБС. 2017. N 124. С. 103–109.Kuzmina TN. Genesis of microsporangium of Jasminum officinale L. (Oleaceae). Byulleten' GNBS. = Bulletin of State Nikitsky Botanical Garden. 2017;124;103–109. (In Russian)Жинкина Н.А., Воронова О.Н. К методике окраски эмбриологических препаратов // Ботанический журнал. 2000. Т. 85. N 6. С. 168–171.Zhinkina NA, Voronova ON. To the technique of staining embryological preparations. Botanicheskii zhurnal. = Botanical journal. 2000;85(6): 168–171. (In Russian)Иванова Н.Н., Митрофанова И.В., Кузьмина Т.В., Хохлов С.Ю. Регенерация микропобегов в культуре высечек листьев хурмы восточной // Роль ботанических садов и дендрариев в сохранении, изучении и устойчивом использовании разнообразия растительного мира: материалы Международной научной конференции, посвящ. 85-летию Центрального ботанического сада НАН Беларуси (г. Минск, 6–8 июня 2017 г.). В 2 ч. Ч. 2. Минск: Медисонт, 2017. С. 209–212.Ivanova NN, Mitrofanova IV, Kuz'mina TV, Khokhlov SYu. Regeneratsiya mikropobegov v kul’ture vysechek list’ev khurmy vostochnoi = Regeneration of microtuning in the culture of carvings of east persimmon leaves. In: Rol' botanicheskikh sadov i dendrariev v sokhranenii, izuchenii i ustoichivom ispol'zovanii raznoobraziya rastitel'nogo mira: materialy Mezhdunarodnoi nauchnoi konferentsii, posvyashchennoi 85-letiyu Tsentral'nogo botanicheskogo sada NAN Belarusi = The role of botanical gardens and arboretums in the conservation, study and sustainable use of plant diversity: Proceedings of the International Scientific Conference dedicated to the 85th anniversary of the Central Botanical Garden of the National Academy of Sciences of Belarus. Part 2. 6–8 June 2017, Minsk. Minsk: Medisont; 2017. P. 209– 212. (In Russian)Молканова О.И., Коновалова Л.Н., Стахеева Т.С. Формирование генетического банка in vitro плодових и ягодных культур в ГБС РАН // Плодоводство и ягодоводство в России. 2016. Т. ХХХХIV. С. 197–200.Molkanova OI, Konovalova LN, Stakheeva TS. Formation of an in vitro genetic bank for fruit and berry crops at the GBS RAS. Plodovodstvo i yagodovodstvo v Rossii. = Pomiculture and small fruits culture in Russia. 2016;44:197–200. (In Russian)Conservation of plant genetic resources in vitro: General aspects / Razdan M.K., Cocking E.C. (eds.). Enfield, NH: Science Publishers, Inc.; 1997. 314 p.Conservation of plant genetic resources in vitro: General aspects. Razdan MK, Cocking EC. (eds.) Enfield, NH: Science Publishers, Inc.; 1997. 314 p.Тевфик А.Ш., Митрофанова И.В. Особенности получения и сохранения Сanna × hybridа hort. ex Backer в условиях in vitro // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2017. Т. 7. N 3. С. 99–109. https://doi.org/10.21285/2227-2925-2017-7-3-99-109Tevfik ASh, Mitrofanova IV. In vitro derivation and storage characteristics of Canna × hybrida hort. ex Backer. Izvestiya Vuzov. Prikladnaya Khimiya i Biotekhnologiya = Proceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology. 2017;7(3):99–109. (In Russian) https://doi.org/10. 21285/2227-2925-2017-7-3-99-109Watt M.P., Thokoane N.L., Mycock D., Blakeway F. In vitro storage of Eucalyptus grandis germplasm under minimal growth conditions // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2000. Vol. 61. Issue 2. Р. 161–164.Watt MP, Thokoane NL, Mycock D, Blakeway F. In vitro storage of Eucalyptus grandis germplasm under minimal growth conditions. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2000;61(2):161–164.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.