vuzbiochemiИзвестия вузов. Прикладная химия и биотехнологияProceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology2227-29252500-1558ИРНИТУ10.21285/2227-2925-2022-12-3-406-416vuzbiochemi-845Research ArticleФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯPHYSICOCHEMICAL BIOLOGYПрименение сканирующей электронной микроскопии и ИК-спектроскопии для экспресс-оценки морфологии и химического состава бактериальных пленок при периодическом культивированииApplication of scanning electron microscopy and IR spectroscopy for a timely evaluation of the morphology and chemical composition of bacterial films during batch cultivationhttps://orcid.org/0000-0002-2872-732XФайзуллинД. А.FaizullinD. A.

Джигангир Асхатович Файзуллин, старший научный сотрудник

420111, г. Казань, ул. Лобачевского, 2

Djigangir A. Faizullin, Senior Researcher

2, Lobachevsky St., 420111, Kazan

dfaizullin@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9070-739XКобелевА. В.KobelevA. V.

Алексей Витальевич Кобелев, ведущий инженер

420015, г. Казань, ул. Карла Маркса, 68

Aleksei V. Kobelev, Lead Engineer

68, Karl Marx St., 420015, Kazan

alexei-ksu@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-5459-974XКлементьевС. В.Klement’evS. V.

Святослав Владимирович Клементьев, магистрант, техник 1 категории

420015, г. Казань, ул. Карла Маркса, 68

Svyatoslav V. Klement’ev, Master’s Student, Technician of the 1st category

68, Karl Marx St., 420015, Kazan

slava_klementev3715@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-4480-9907СироткинА. С.SirotkinA. S.

Александр Семенович Сироткин, д.т.н., профессор, заведующий кафедрой промышленной биотехнологии

420015, г. Казань, ул. Карла Маркса, 68

Alexander S. Sirotkin, Dr. Sci. (Engineering), Professor, Head of Industrial Biotechnology Department

68, Karl Marx St., 420015, Kazan

asirotkin66@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-7086-4280РоговА. М.RogovA. M.

Алексей Михайлович Рогов, инженер

420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18

Aleksei M. Rogov, Engineer

18, Kremlevskaya St., 420008, Kazan

alexeyrogov111@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-2367-672XСальниковВ. В.SalnikovV. V.

Вадим Владимирович Сальников, заведующий лабораторией

420111, г. Казань, ул. Лобачевского, 2

Vadim V. Salnikov, Head of Laboratory

2, Lobachevsky St., 420111, Kazan

vadim.salnikov.56@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-2367-672XМакшаковаО. Н.MakshakovaO. N.

Ольга Николаевна Макшакова, старший научный сотрудник

420111, г. Казань, ул. Лобачевского, 2

Olga N. Makshakova, Senior Researcher

2, Lobachevsky St., 420111, Kazan

omega12@inbox.ruhttps://orcid.org/0000-0002-6715-2530ЗуевЮ. Ф.ZuevYu. F.

Юрий Федорович Зуев, руководитель лаборатории биофизической химии наносистем

420111, г. Казань, ул. Лобачевского, 2

Yurii F. Zuev, Head of the Laboratory of Biophysical Chemistry of Nanosystems

2, Lobachevsky St., 420111, Kazan

yufzuev@mail.ruКазанский институт биохимии и биофизики ФИЦ КазНЦ РАНРоссияKazan Institute of Biochemistry and Biophysics FRC KazSC RASRussian FederationКазанский национальный исследовательский технологический университетРоссияKazan National Research Technological UniversityRussian FederationКазанский федеральный университетРоссияKazan Federal UniversityRussian Federation202206102022123406416Copyright © Файзуллин Д.А., Кобелев А.В., Клементьев С.В., Сироткин А.С., Рогов А.М., Сальников В.В., Макшакова О.Н., Зуев Ю.Ф., 20222022Файзуллин Д.А., Кобелев А.В., Клементьев С.В., Сироткин А.С., Рогов А.М., Сальников В.В., Макшакова О.Н., Зуев Ю.Ф.Faizullin D.A., Kobelev A.V., Klement’ev S.V., Sirotkin A.S., Rogov A.M., Salnikov V.V., Makshakova O.N., Zuev Y.F.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vuzbiochemi.elpub.ru/jour/article/view/845

Основной формой существования бактерий в природе являются биопленки – прикрепленные к субстрату ассоциации клеток, окруженные полимерным матриксом. Изучение образования и функционирования биопленок имеет фундаментальное значение для управления процессами формирования микробных ассоциатов в экологии, биотехнологии и медицине. Поставленная цель требует разработки аналитических подходов, позволяющих при сохранении интактной структуры биопленок получать оперативную информацию на протяжении всего цикла жизнедеятельности микробного сообщества. В задачу работы входила адаптация методов сканирующей электронной микроскопии и ИК-спектроскопии в качестве экспресс-метода анализа микробных биопленок. Для этого проведено сопоставительное изучение кинетики роста культуры бактерий Bacillus subtilis в течение 24 ч культивирования на твердом субстрате методами классической микробиологии и биохимии, электронной сканирующей микроскопии и Фурье ИК-спектроскопии. Установлено, что морфология биопленки меняется от равномерного заселения поверхности носителя планктонными клетками на начальной стадии роста (6 ч) до накопления внеклеточного матрикса и образования микроколоний в экспоненциальной и стационарной фазе (12–18 ч) и постепенного истощения матрикса в фазе отмирания клеток (24 ч). Результаты ИК-спектроскопии коррелируют с результатами биохимических исследований, что, в свою очередь, позволяет проводить оперативную оценку накопления белков, полисахаридов и нуклеиновых кислот и получать информацию об их структурном состоянии в биопленке. По итогам исследования можно заключить, что сканирующая электронная микроскопия и Фурье ИК-спектроскопия в предложенном варианте применения позволяют получать взаимодополняющую информацию о морфологии и химическом составе микробных биопленок в процессе культивирования.

Bacteria most commonly exist in nature in the form of bacterial biofilms, i.e. associations of cells attached to a substrate surrounded by a polymer matrix. Research into biofilm formation and functioning is fundamental to the management of microbial associations in ecology, biotechnology and medicine. This task requires the development of analytical approaches capable of providing timely information throughout the life cycle of microbial communities at the same time as maintaining their intact structure. In this paper, we apply scanning electron microscopy and IR spectroscopy as rapid methods for analysing microbial biofilms. To this end, the growth kinetics of a Bacillus subtilis culture cultivated on a solid substrate for 24 h was comparatively studied by the methods of classical microbiology and biochemistry, electron scanning microscopy and Fourier-transform IR spectroscopy. The biofilm morphology was found to vary from a uniform settlement of planktonic cells over the substrate surface at the initial stage of growth (6 h) followed by the accumulation of the extracellular matrix and the formation of microcolonies at the exponential and stationary stage (12–18 h) and a gradual depletion of the matrix at the stage of cell death (24 h). The results of IR spectroscopy were established to agree well with those of biochemical studies, thereby demonstrating the potential of the method for a timely evaluation of the accumulation of proteins, polysaccharides and nucleic acids and for obtaining information about their structural state in the studied biofilm. It is concluded that scanning electron microscopy and Fourier-transform IR spectroscopy can be used for obtaining complementary information about the morphology and chemical composition of microbial biofilms during their cultivation.

Bacillus subtilisмикробные биопленкиФурье ИК-спектроскопиясканирующая электронная микроскопияBacillus subtilismicrobial biofilmsFourier-transform IR spectroscopyscanning electron microscopyРабота выполнена в рамках государственного задания Казанского научного центра РАН № 122011800137-0.The work was carried out within the framework of the government assignment 122011800137-0 for Federal Research Center Kazan Scientific Center of RAS.ReferencesAbed S. E., Ibnsouda S. K., Latrache H., Hamadi F. Scanning electron microscopy (SEM) and environmental SEM: suitable tools for study of adhesion stage and biofilm formation. IntechOpen, 2012. 830 p. https://doi.org/10.5772/34990.Abed S. E., Ibnsouda S. K., Latrache H., Hamadi F. Scanning electron microscopy (SEM) and environmental SEM: suitable tools for study of adhesion stage and biofilm formation. IntechOpen; 2012. 830 p. https://doi.org/10.5772/34990.Preisner O., Lopes J. A., Guiomar R., Machado J., Menezes J. C. Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy in bacteriology: towards a reference method for bacteria discrimination // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2007. Vol. 387, no. 5. P. 1739-1748. https://doi.org/10.1007/s00216-006-0851-1.Preisner O., Lopes J. A., Guiomar R., Machado J., Menezes J. C. Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy in bacteriology: towards a reference method for bacteria discrimination. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2007;387(5):1739-1748. https://doi.org/10.1007/s00216-006-0851-1.Уткин Д. В., Куклев В. Е., Ерохин П. С., Осина Н. А. Применение методов спектроскопии для индикации и идентификации патогенных биологических агентов // Проблемы особо опасных инфекций. 2011. N 2. С. 68-71. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2011-2(108)-68-71.Utkin D. V., Kouklev V. E., Erokhin P. S., Ossina N. A. Application of spectroscopy methods for indication and identification of pathogenic biological agents. Problemy osobo opasnykh infektsii = Problems of Particularly Dangerous Infections. 2011;(2):68-71. (In Russian). https://doi.org/10.21055/0370-1069-2011-2(108)-68-71.Рой А. А., Курдиш И. К., Остапюк С. Н., Савельев Ю. В. Влияние условий культивирования Bacillus subtilis ИМВ B-7023 и его стрептомицинустойчивого мутанта на свойства поверхности этих бактерий // Мікробіологічний журнал. 2017. Т. 79. N 4. С. 12-20.Roy A. A., Kurdish I. K., Ostapyuk S. N., Savelyev Yu. V. Influence of the cultivation conditions of Bacillus subtilis IMV B-7023 and its streptomycinresistant mutant on the surface properties of these bacteria. Mіkrobіologіchnii zhurnal. 2017;79(4):12-20. (In Russian). https://doi.org/10.15407/microbiolj79.04.012.Сунцова А. Ю., Гулиев Р. Р., Попов Д. А., Вострикова Т. Ю., Дубоделов Д. В., Щеголихин А. Н. [и др.]. Идентификация микроорганизмов с помощью инфракрасных Фурье-спектров // Вестник Российского государственного медицинского университета. 2018. N 4. С. 57-65. https://doi.org/10.24075/vrgmu.2018.046.Suntsova A. Yu., Guliev R. R., Popov D. A., Vostrikova T. Yu., Dubodelov D. V., Shchegolikhin A. N., et al. Identification of microorganisms by fourier-transform infrared spectroscopy. Vestnik Rossiiskogo gosudarstvennogo meditsinskogo universiteta = Bulletin of Russian State Medical University. 2018;(4):57-65. https://doi.org/10.24075/vrgmu.2018.046.Rodriguez-Saona L. E., Khambaty F. M., Fry F. S., Dubois J., Calvey E. M. Detection and identification of bactеria in a juce matrix with Fourier transform-near infrared spectroscopy and multivariate analysis // Journal of Food Protection. 2004. Vol. 67, no. 11. P. 2555-2559. https://doi.org/10.4315/0362-028x-67.11.2555.Rodriguez-Saona L. E., Khambaty F. M., Fry F. S., Dubois J., Calvey E. M. Detection and identification of bactеria in a juce matrix with Fourier transform-near infrared spectroscopy and multivariate analysis. Journal of Food Protection. 2004;67(11):2555-2559. https://doi.org/10.4315/0362-028x-67.11.2555.Rebuffo C. A., Schmitt J., Wenning M., von Stetten F., Scherer S. Reliable and rapid identification of Listeria monocytogenes and Listeria species by artificial neural network-based Fourier transform infrared spectroscopy // Applied and Environmental Microbiology. 2006. Vol. 72, no. 2. P. 994-1000. https://doi.org/10.1128/AEM.72.2.994-1000.2006.Rebuffo C. A., Schmitt J., Wenning M., von Stetten F., Scherer S. Reliable and rapid identification of Listeria monocytogenes and Listeria species by artificial neural network-based Fourier transform infrared spectroscopy. Applied and Environmental Microbiology. 2006;72(2):994-1000. https://doi.org/10.1128/AEM.72.2.994-1000.2006.Wenning M., Buchl N. R., Scherer S. Species and strain identification of lactic acid bacteria using FTIR spectroscopy and artificial neural networks // Journal of Biophotonics. 2010. Vol. 3, no. 8-9. P. 493-505. https://doi.org/10.1002/jbio.201000015.Wenning M., Buchl N. R., Scherer S. Species and strain identification of lactic acid bacteria using FTIR spectroscopy and artificial neural networks. Journal of Biophotonics. 2010;3(8-9):493-505. https://doi.org/10.1002/jbio.201000015.Ma W., Peng D., Walker S. L., Cao B., Gao C.-H., Huang Q., et al. Bacillus subtilis biofilm development in the presence of soil clay minerals and iron oxides // NPJ. Biofilms and Microbiomes. 2017. Vol. 3. Article number: 4. https://doi.org/10.1038/s41522-017-0013-6.Ma W., Peng D., Walker S. L., Cao B., Gao C.-H., Huang Q., et al. Bacillus subtilis biofilm development in the presence of soil clay minerals and iron oxides. NPJ. Biofilms and Microbiomes. 2017;3. Article number: 4. https://doi.org/10.1038/s41522-017-0013-6.Humbert F., Quilès F. In-situ study of early stages of biofilm formation under different environmental stresses by ATR-FTIR spectroscopy. In: Science against microbial pathogens: communicating current research and technological advances. Badajoz: Formatex Research Center, 2011. P. 889-895.Humbert F., Quilès F. In-situ study of early stages of biofilm formation under different environmental stresses by ATR-FTIR spectroscopy. In: Science against microbial pathogens: communicating current research and technological advances. Badajoz: Formatex Research Center; 2011, p. 889-895.Tugarova A. V., Scheludko A. V., Dyatlova Yu. A., Filip’echeva Yu. A., Kamnev A. A. FTIR spectroscopic study of biofilms formed by the rhizobacterium Azospirillum brasilense Sp245 and its mutant Azospirillum brasilense Sp245.1610 // Journal of Molecular Structure. 2017. Vol. 1140. P. 142-147. https://doi.org/10.1016/j.molstruc.2016.12.063.Tugarova A. V., Scheludko A. V., Dyatlova Yu. A., Filip’echeva Yu. A., Kamnev A. A. FTIR spectroscopic study of biofilms formed by the rhizobacterium Azospirillum brasilense Sp245 and its mutant Azospirillum brasilense Sp245.1610. Journal of Molecular Structure. 2017;1140:142-147. https://doi.org/10.1016/j.molstruc.2016.12.063.Кобелев А. В., Клементьев С. В., Вдовина Т. В., Сироткин А. С. Оценка активности внеклеточных лектинов бактерий в формировании агрегированных микробных форм // Бутлеровские сообщения. 2021. Т. 65. N 1. С. 105-113. https://doi.org/10.37952/ROI-jbc-01/21-65-1-105.Kobelev A. V., Klementyev S. V., Vdovina T. V., Sirotkin A. S. Evaluation of the activity of bacterial extracellular lectins in the formation of aggregated microbial forms. Butlerovskie soobshcheniya = Butlerov Communications. 2021;65(1):105-113. https://doi.org/10.37952/ROI-jbc-01/21-65-1-105.Merritt J. H., Kadouri D. E., O’Toole G. A. Growing and analyzing static biofilms // Current Protocols in Microbiology. 2005. https://doi.org/10.1002/9780471729259.mc01b01.Merritt J. H., Kadouri D. E., O’Toole G. A. Growing and analyzing static biofilms. Current Protocols in Microbiology. 2005. https://doi.org/10.1002/9780471729259.mc01b01.Хабибуллина А. Р., Вдовина Т. В., Кобелева Й. В., Сироткин А. С. Исследование процесса биологической дефосфотации модельных сред с использованием фосфатаккумулирующих бактерий // Вестник технологического университета. 2017. Т. 20. N 19. С. 131-133.Chabibullina A. P., Vdovina T. V., Kobeleva J. V., Sirotkin A. S. Study of the process of biological dephosphatization of model media using phosphate-accumulating bacteria. Vestnik tekhnologicheskogo universiteta. 2017;20(19):131-133. (In Russian).Годовалов А. П., Карпунина Т. И. Определение компонентного состава биопленок грамположительных бактерий // Клиническая лабораторная диагностика. 2019. Т. 64. N 10. С. 632-634. https://doi.org/10.18821/0869-2084-2019-64-10-632-634.Godovalov A. P., Karpunina T. I. The determination of biofilm composition of gram-positive bacteria. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika = Russian Clinical Laboratory Diagnostics. 2019;64(10):632-634. https://doi.org/10.18821/0869-2084-2019-64-10-632-634.Nayak N., Nag T. C., Satpathy G., Ray S. B. Ultrastructural analysis of slime positive & slime negative Staphylococcus epidermidis isolates in infectious keratitis // Indian Journal of Medical Research. 2007. Vol. 125, no. 6. P. 767-771.Nayak N., Nag T. C., Satpathy G., Ray S. B. Ultrastructural analysis of slime positive & slime negative Staphylococcus epidermidis isolates in infectious keratitis. Indian Journal of Medical Research. 2007;125(6):767-771.Litvinov R. I., Faizullin D. A., Zuev Yu. F., Weisel J. W. The a-helix to β-sheet transition in stretched and compressed hydrated fibrin clots // Biophysical Journal. 2012. Vol. 103, no. 5. P. 1020-1027. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2012.07.046.Litvinov R. I., Faizullin D. A., Zuev Yu. F., Weisel J. W. The a-helix to β-sheet transition in stretched and compressed hydrated fibrin clots. Biophysical Journal. 2012;103(5):1020-1027. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2012.07.046.Wang H., Ding S., Wang G., Xu X., Zhou G. In situ characterization and analysis of Salmonella biofilm formation under meat processing environments using a combined microscopic and spectroscopic approach // International Journal of Food Microbiology. 2013. Vol. 167, no. 3. P. 293-302. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2013.10.005.Wang H., Ding S., Wang G., Xu X., Zhou G. In situ characterization and analysis of Salmonella biofilm formation under meat processing environments using a combined microscopic and spectroscopic approach. International Journal of Food Microbiology. 2013;167(3):293-302. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2013.10.005.Gieroba B., Krysa M., Wojtowicz K., Wiater A., Pleszczyńska M., Tomczyk M., et al. The FTIR and raman spectroscopies as tools for biofilm characterization created by cariogenic streptococci // International Journal of Molecular Sciences. 2020. Vol. 21, no. 1. P. 3811. https://doi.org/10.3390/ijms21113811.Gieroba B., Krysa M., Wojtowicz K., Wiater A., Pleszczyńska M., Tomczyk M., et al. The FT-IR and raman spectroscopies as tools for biofilm characterization created by cariogenic streptococci. International Journal of Molecular Sciences. 2020;21(1):3811. https://doi.org/10.3390/ijms21113811.McCutcheon J., Southam G. Advanced biofilm staining techniques for TEM and SEM in geomicrobiology: Implications for visualizing EPS architecture, mineral nucleation, and microfossil generation // Chemical Geology. 2018. Vol. 498. P. 115-127. https://doi.org/10.1016/j.chemgeo.2018.09.016.McCutcheon J., Southam G. Advanced biofilm staining techniques for TEM and SEM in geomicrobiology: Implications for visualizing EPS architecture, mineral nucleation, and microfossil generation. Chemical Geology. 2018;498:115-127. https://doi.org/10.1016/j.chemgeo.2018.09.016.Ярец Ю. И., Шевченко Н. И. Новый метод анализа бактериальной биопленки // Наука и инновации. 2016. N 10. С. 64‒68.Yarets Yu. I., Shauchenka N. I. A new method for the bacterial biofilms analysis in medicine. Nauka i innovatsii. 2016;(10):64-68. (In Russian).Клементьев С. В., Кобелев А. В., Сироткин А. С. О формировании клеточных агрегатов под действием бактериальных лектинов // Пищевые технологии и биотехнологии: материалы ХVII Всероссийской конференции молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием, посвященная Году науки и технологий в Российской Федерации (г. Казань, 20-23 апреля 2021 г.). Казань: КНИТУ, 2021. С. 453-458.Klementev S. V., Kobelev A. V., Sirotkin A. S. About formation of cell aggregates under the action of bacterial lectins. In: Pishchevye tekhnologii i biotekhnologii: materialy XVII Vserossiiskoi konferentsii molodykh uchenykh, aspirantov i studentov s mezhdunarodnym uchastiem, posvyashchennaya Godu nauki i tekhnologii v Rossiiskoi Federatsii = Food technologies and biotechnologies: materials of the XVII All-Russian Conference of Young Scientists, Postgraduates and Students with International Participation, dedicated to the Year of Science and Technology in the Russian Federation. Kazan: Kazanskii natsional’nyi issledovatel’skii tekhnologicheskii universitet, 2021; p. 453-458. (In Russian).Branda S. S., Chu F., Kearns D. B., Losick R., Kolter R. A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix // Molecular Microbiology. 2006. Vol. 59, no. 4. P. 1229-1238. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2005.05020.x.Branda S. S., Chu F., Kearns D. B., Losick R., Kolter R. A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix. Molecular Microbiology. 2006;59(4):1229-1238. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2005.05020.x.Epstein A. K., Pokroy B., Seminara A., Aizenberg J. Bacterial biofilm shows persistent resistance to liquid wetting and gas penetration // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2010. Vol. 108, no. 3. P. 995-1000. https://doi.org/10.1073/pnas.1011033108.Epstein A. K., Pokroy B., Seminara A., Aizenberg J. Bacterial biofilm shows persistent resistance to liquid wetting and gas penetration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2010;108(3):995-1000. https://doi.org/10.1073/pnas.1011033108.Бисенова Г. Н., Торина А. К., Шегебаева А. А. Изучение динамики роста бактерий родов Bacillus и Pseudomonas при периодическом культивировании // Вестник науки Казахского агротехнического университета им. С. Сейфуллина. 2014. Т. 82. N 3. C. 3-9.Bisenova G. N., Torina A. K., Shegebaeva A. A. Study of the dynamics of growth of bacteria of the genera Bacillus and Pseudomonas during periodic cultivation. Vestnik nauki Kazakhskogo agrotekhnicheskogo universiteta im. S. Seifullina = Herald of Science of S Seifullin Kazakh Agro Technical University. 2014;82(3):3-9. (In Russian).Шарипова М. Р., Марданова А. М., Рудакова Н. Л., Пудова Д. С. Бистабильность и формирование матрикса биопленки как механизмы адаптации Bacillus subtilis в стационарной фазе // Микробиология. 2021. Т. 90. N 1. С. 24-42. https://doi.org/10.31857/S0026365620060178.Sharipova M. R., Mardanova A. M., Rudakova N. L., Pudova D. S. Bistability and formation of the biofilm matrix as adaptive mechanisms during the stationary phase of Bacillus Subtilis. Mikrobiologiya. 2021;90(1):24-42. https://doi.org/10.31857/S0026365620060178.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.