Методические рекомендации в использовании антител против дегидринов в агробиотехнологиях

Детекция уровня экспрессии дегидринов в растениях становится распространенным приемом в тестировании устойчивости растений к холоду, засухе, засоленности почвы или высокому содержанию в ней ионов тяжелых металлов. Наиболее простым способом оценки содержания дегидринов является использование специфических антител, при этом специфичность антител является критическим моментом. На основании опыта определения дегидринов у различных растительных объектов авторами данной статьи была поставлена задача – сравнить реакции с антителами реакционноспособных белков, полученных из трех наиболее доступных источников, оценить их специфичность. Сопоставимость детектируемых антителами белков по количеству и молекулярной массе была исследована на нескольких растительных объектах: 1) суммарный и термостабильный белок хвои сосны обыкновенной, 2) белок митохондрий гороха; 3) суммарный и термостабильный белок озимой пшеницы; 4) суммарный и термостабильный белок арабидопсиса. Во всех случаях использования антител наблюдали либо слабые, либо существенные различия в количестве и молекулярной массе детектируемых групп белков. Эти различия можно объяснить тремя возможными причинами: вариабельность К-сегмента, разные белки-носители, используемые производителями, и наличие общих реакционноспособных эпитопов у некоторых групп белков, не являющихся дегидринами. При анализе различий в количестве детектируемых групп при использовании антител от разных производителей установлено, что они минимальны у злаковых растений и становятся больше у двудольных и хвойных, причем наибольшее количество детектируемых групп отмечено у митохондрий гороха. Часть связывающихся с антителами групп белков определенно не является дегидринами. Упомянутые различия меньше у термостабильных белков. Таким образом, получение термостабильной фракции белков можно рекомендовать в качестве простой процедуры, повышающей уверенность в детекции дегидринов. Использование сравнения количества дегидринов в качестве меры относительной устойчивости различных растений не следует применять при сравнении эволюционно далеких друг от друга видов, поскольку реакционноспособность антител к дегидринам далеких друг от друга видов может существенно отличаться. В то же время этот метод может быть рекомендован в агробиологии для оценки на молекулярном уровне исходной или индуцированной устойчивости сортов растений одного и того же вида, либо родственных видов к замерзанию, засухе и другим неблагоприятным условиям, связанным с дефицитом воды.

дегидрины, устойчивость растений, вестерн-блоттинг, антитела

1. Galau G.A., Hughes D.W., Dure L. Abscisic acid induction of cloned cotton late embryogenesisabundant (Lea) mRNAs // Plant Molecular Biology. 1986. Vol. 7. Issue 3. P. 155–170. DOI: https://doi.org/10.1007/BF00021327

2. Thomashow M.F. Plant cold acclimation: Freezing Tolerance Genes and Regulatory Mechanisms // Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 1999. Vol. 50. P. 571–599. DOI: https://doi.org/10.1146/annurev.arplant.50.1.571.

3. Close T.J. Dehydrins: A commonalty in the response of plants to dehydration and low temperature // Physiologia Plantarum. 1997. Vol. 100. P. 291–296. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.1997.tb04785.x

4. Hanin M., Brini F.E., Ebel C., Toda Y., Takeda S., Masmoudi K. Plant dehydrins and stress tolerance: Versatile proteins for complex mechanisms // Plant Signaling & Behavior. 2011. Vol. 6. P. 1503–1509. DOI: https://doi.org/10.4161/psb.6. 10.17088

5. Graether S.P., Boddington K.F. Disorder and function: a review of the dehydrin protein family // Front Plant Sci. 2014. Vol. 5. P. 1–12. DOI: https://doi.org/10.3389/fpls.2014.00576

6. Banerjee A., Roychoudhury A. Group II late embryogenesis abundant (LEA) proteins: structural and functional aspects in plant abiotic stress // Plant Growth Regulation. 2016. Vol. 79. Issue 1. P. 1–17. DOI: https://doi.org/10.1007/s10725-015-0113-3

7. Vítámvás P., Kosová K., Musilová J., Holková L., Marík P., Smutná P., Klíma M., Prášil I.T. Relationship Between Dehydrin Accumulation and Winter Survival in Winter Wheat and Barley Grown in the Field // Frontiers in Plant Science. 2019. Vol.10. A. 7 DOI: 10.3389/fpls.2019.00007

8. Боровский Г.Б., Ступникова И.В., Пешкова А.А., Дорофеев Н.В., Войников В.К. Термостабильные белки проростков и узлов кущения растений озимой пшеницы // Физиология растений. 1999. Т. 46. С. 777–783.

9. Stupnikova I.V., Borovskii G.B., Dorofeev N.V., Peshkova A.A., Voinikov V.K. Accumulation and disappearance of dehydrins and sugars depending on freezing tolerance of winter wheat plants at different developmental phases // Journal of Thermal Biology. 2002. Vol. 27. P. 55–60. DOI: https://doi.org/10.1016/S0306-4565(01)00015-8

10. Pomortsev А.V., Dorofeev N.V., Katysheva N.B., Peshkova А.А. Changes in dehydrin composition in winter cereal crowns during winter survival // Biologia Plantarum. 2017. Vol. 61. P. 394–398. DOI: 10.1007/s10535-016-0673-8

11. Yu Zhengyang, Wang Xin, Zhang Linsheng Structural and Functional Dynamics of Dehydrins: A Plant Protector Protein under Abiotic Stress // Int. J. Mol. Sci. 2018. Vol. 19. No. 11. P. 3420. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms19113420

12. Timmons T.M., Dunbar B.S. Protein blotting and immunodetection // Methods in Enzymology. 1990. Vol. 182. P. 679–688. DOI: https://doi.org/10.1016/0076-6879(90)82053-5

13. Weiland G. The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)--a new serodiagnostic method for the detection of parasitic infections // Munchener medizinische Wochenschrift. 1978. Vol. 120. P. 1457–1460.

14. Close T.J., Fenton R.D., Moonan F. A view of plant dehydrins using antibodies specific to the carboxyterminal peptide // Plant Molecular Biology. 1993. Vol. 23. P. 279–286. DOI: https://doi.org/10.1007/BF00029004.

15. Korotaeva N.E., Oskorbina M.V., Kopytova L.D., Suvorova G.G., Borovskii G.B., Voinikov V.K. Variations in the content of stress proteins in the needles of common pine (Pinus sylvestris L.) within an annual cycle // Journal of Forest Research. 2012. Vol. 17. P. 89–7. DOI: https://doi.org/10.1007/s10310-011-0260-y

16. Grabel’nykh O.I., Pobezhimova T.P., Pavlovskaya N.S., Koroleva N.A., Borovik O.A., Lyubushkina I.V., Voinikov V.K. Antioxidant function of alternative oxidase in mitochondria of winter wheat during cold hardening // Biochemistry (Moscow) Supplement Series A: Membrane and Cell Biology. 2011. Vol. 5. No. 3. P. 249–257. DOI: 10.1134/S1990747811040040

17. Bradford M.M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding // Analytical biochemistry. 1976. Vol. 72. P. 248–254. DOI: https://doi.org/10.1016/0003-2697(76)90527-3

18. Jarvis S.B., Taylor M.A., Macleod M.R., Davies H.V. Cloning and Characterisation of the cDNA Clones of three Genes that are differentially Expressed during Dormancy-Breakage in the Seeds of Douglas Fir (Pseudotsuga menziesii) // Journal of Plant Physiology. 1996. Vol. 147. P. 559–566. DOI: https://doi.org/10.1016/S0176-1617(96)80046-0