Глубинное культивирование микромицета Trichoderma asperellum ВКПМ F-1323 в опытно-промышленных условиях

Цель данного исследования – разработка опытно-промышленного метода получения биофунгицида на основе гриба рода Trichoderma. Культивирование проводилось глубинным способом в опытно-промышленной линии ферментеров с ферментером-инокулятором общим объемом 10 л и рабочим ферментером общим объемом 100 л. В качестве питательной среды была использованамодифицированная среда Чапека с добавлением дрожжевого экстракта и заменой сахарозы на ме-лассу, г/л: меласса – 20; дрожжевой экстракт – 7; NaNO₃ – 2; K₂HPO₄ – 1; MgSO₄ – 0,5; KCl – 0,5; FeSO₄ – 0,01. Культивирование проводилось с поддержанием следующих параметров: температура – 27±0,5 °С; скорость перемешивания культуральной среды – 600 об./мин; интенсивность аэрации – 1 л воздуха на 1 л питательной среды в мин. Инокулят выращивался на питательной среде аналогич-ного состава в качалочных колбах объемом 750 мл c рабочим объемом 100 мл. Инокулированные колбы инкубировались на шейкере-инкубаторе Innova 40R (New Brunswick, США) при 200 об./мин в течение 22–24 ч до достижения показателя сухой биомассы в пределах 6,5–7,5 г/л. Подсчет концентрации конидий осуществляли с использованием камеры Горяева. В качестве метода культивирования было выбрано жидкостное в связи с его относительно быстрым протеканием. Кроме того, в отличие от твердофазного культивирования глубинное позволяется аккумулировать в готовой товарной форме препарата многочисленные вторичные метаболиты, обладающие антагонистической активностью по отношению к фитопатогенам. В качестве объекта исследования выступал штамм Trichoderma asperellum ВКПМ F-1323, обладающий антагонистической активностью по отношению ко многим фитопатогенам. В результате проведенных экспериментов было установлено, что с технико-экономической точки зрения обосновано внесение культуры для засева ферментера-инокулятора в количестве 5 % об. Изучено влияние различной продолжительности культивирования в ферментере-инокуляторе на скорость роста микромицета в рабочем ферментере. Определено, что оптимальное время для пересева в рабочий ферментер находится в пределах 20–24 ч. По окончании процесса культивирования концентрация конидий составила 1,9·108 конидий/мл.

1. Damalas C.A., Koutroubas S.D. Current status and recent developments in biopesticide use // Agriculture 2018. Vol. 8. Issue 1. 13 p. https://doi.org/10.3390/agriculture8010013

2. Olson S. An analysis of the biopesticide market now and where it is going // Outlooks on Pest Management. 2015. Vol. 26. N 5. P. 203–206. https://doi.org/10.1564/v26_oct_04

3. Srivastava M., Vipul K., Mohamad S., Pandey S., Anuradha S. Trichoderma – a potential and effective bio fungicide and alternative source against notable phytopathogens: A review // African Journal of Agricultural Research. 2016. Vol. 11. Issue 5. P. 310–316. https://doi.org/10.5897/AJAR2015.9568

4. Waghunde R.R., Shelake R.M., Sabalpara A.N. Trichoderma: A significant fungus for agriculture and environment // African Journal of Agricultural Research. 2016. Vol. 11. Isue 22. P. 1952–1965. https://doi.org/10.5897/AJAR2015.10584

5. Vos C.M., De Cremer K., Cammue B.P., De Coninck B. The toolbox of Trichoderma spp. in the biocontrol of Botrytis cinerea disease // Molecular Plant Pathology. 2015. Vol. 16. Issue 4. P. 400–412. https://doi.org/10.1111/mpp.12189

6. Sadykova V.S., Kurakov A.V., Kuvarina A.E., Rogozhin E.A. Antimicrobial activity of fungi strains of Trichoderma from Middle Siberia // Applied Biochemistry and Microbiology. 2015. Vol. 51. Issue 3. P. 355–361. https://doi.org/10.1134/S000368381503014X

7. Keszler A., Forgács E., Kótai L., Vizcaíno J.A., Monte E., García-Acha I. Separation and identification of volatile components in the fermentation broth of Trichoderma atroviride by solid-phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry // Journal of Chromatographic Science. 2000. Vol. 38. Issue 10. P. 421–424. https://doi.org/10.1093/chromsci/38

8. Vinale F., Sivasithamparam K., Ghisalberti E.L., Marra R., Woo S.L., Lorito M. Tricho-derma–plant–pathogen interactions // Soil Biology and Biochemistry. 2008. Vol. 40. Issue 1. P. 1–10. https://doi.org/10.1016/j.soilbio.2007.07.002

9. Алимова Ф.К. Промышленное применение грибов рода Trichoderma. Казань: Изд-во Казанского государственного университета, 2006. 209 с.

10. Mukherjee P.K., Wiest A., Ruiz N., Keightley A., Moran-Diez M.E., McCluskey K., et al. Two classes of new peptaibols are synthesized by a single non-ribosomal peptide synthetase of Trichoderma virens // Journal of Biological Chemistry. 2011. Vol. 286. Issue 6. P. 4544–4554. https://doi.org/10.1074/jbc.M110.159723

11. Зиганшин Д.Д., Захаров В.В., Сироткин А.С., Егоршина А.А., Лукьянцев М.А. Влияние различных источников углерода на конидиеобразование микромицета Trichoderma asperellum OPF-19 в условиях глубинного культивирования // Биотехнология: состояние и перспективы развития. 2017. С. 115–117.

12. Пат. № 2634415 С1, Российская Федерация. C12N1/14; A01N63/04. Штамм гриба Trichoderma asperellum для получения биопрепарата комплексного действия для растениеводства / А.А. Егоршина, М.А. Лукьянцев, Д.Д. Зиганшин, Ю.В. Лесянкина, О.И. Лапина, Г.Х. Шаймуллина [и др.]; патентообладатель ООО «Органик парк»; заявл. 02.08.2016; опубл. 26.10.2017. Бюл. N 30.

13. Пат. № 2658430, Российская Федерация. Способ получения биопрепарата для обработки растений / А.А. Егоршина, М.А. Лукьянцев, Д.Д. Зиганшин, В.В. Захаров, Н.В. Бадрутдинов; заявл. 26.12.2016; опубл. 21.06.2018. Бюл. N 18.

14. Sonnleitner B., Locher G., Fiechter A. Biomass determination // Journal of Biotechnology. 1992. Vol. 25. Issue 1-2. P. 5–22. https://doi.org/10.1016/0168-1656(92)90107-K

15. Темершин Д.Д., Новоселов А.Г., Гуляева Ю.Н., Шуваев Е.В. Исследование процесса культивирования чистой культуры пивных дрожжей в кожухотрубном струйно-инжекционном аппарате // Ползуновский вестник. 2018. N. 4. С. 78– 83. https://doi.org/10.25712/ASTU.2072-8921.2018.04.016663.132

16. Schultz D., Kishony R. Optimization and control in bacterial lag phase // BMC Biology. 2013. Vol. 11. Issue 1. P. 120. https://doi.org/10.1186/1741-7007-11-120

17. Pelley J.W. Citric acid cycle, electron transport chain, and oxidative phosphorylation. In: Elsevier's Integrated Review Biochemistry. 2nd ed. Philadelphia, PA: WB Saunders. 2012. P. 57–65. https://doi.org/10.1016/B978-0-323-03410-50013-4