Разработка подходов скрининга высокоспецифичных бактериофагов на основе биоинформационного анализа структур CRISPR-Cas систем Corynebacterium diphtheriae

Целью настоящего исследования являлась разработка подходов скрининга высокоспецифичных бактериофагов на основе биоинформационного анализа структур CRISPR-Cas систем бактерий на примере Corynebacterium diphtheriae. Предложен алгоритм биоинформационного поиска и анализа структур CRISPR-Cas систем бактерий и скрининга фагов через спейсерные последовательности CRISPR-кассет в геномах штаммов Corynebacterium diphtheriae. В качестве объекта выбраны 22 полногеномные последовательности, загруженные из базы данных GenBank. Из них у 21 штамма обнаружены CRISPR-Cas системы. При помощи нескольких алгоритмов поиска в CRISPR-Cas системах исследуемых штаммов в 23,8% случаев определено наличие одной CRISPR-кассеты, в 76,2% случаев - двух. Рядом с кассетами идентифицирован полный набор Cas-генов, характерный для двух типов систем: Type-I Subtype-I-Е и Type-II Subtype-II-C. Анализ спейсерного состава CRISPR-кассет показал наличие от 3 до 42 спейсеров в кассетах. Совокупное количество выявленных спейсеров составило 297. Из них 64 спейсера повторялись в двух и более CRISPR-кассетах, 159 спейсеров не имели повторов. Три пары исследуемых штаммов из данной группы имели полное совпадение спейсерных и консенсусных последовательностей, хотя были выделены в разное время и в разных странах мира. Для подтверждения их единого происхождения был проведен филогенетический анализ. Скрининг фагов через спейсерные последовательности показал наибольшее соответствие спейсеров протоспейсерам фагов, специфичных для бактерий семейства Mycobacteriaceae, Gordoniaceae, Streptomycetaceae, Corynebacteriaceae, относящихся к одному типу Actinobacteria. Был выявлен один штамм, обладающий множественной антибиотикорези-стентностью, и с помощью данной технологии определена его предполагаемая устойчивость к бактериофагам. Таким образом, разработанная технология биоинформационного анализа позволила получить сведения о предполагаемой устойчивости CRISPR-Cas системы исследуемых штаммов к обнаруженным фагам, что в перспективе дает возможность создания платформы для разработки подходов персонифицированной фаготерапии.

1. Ивашко С. Нобелевская премия по химии досталась открывателям самого быстрого и точного метода генетического редактирования // Коммерсантъ Наука. 2020. N 33. C. 5.

2. Makarova K.S., Wolf Y.I., Koonin E.V. Comparative genomics of defense systems in archaea and bacteria // Nucleic Acids Research. 2013. Vol. 41. Issue 8. P. 4360-4377. https://doi.org/10.1093/nar/gkt157

3. Bolotin A., Quinquis B., Sorokin A., Ehrlich S.D. Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of ex-trachromosomal origin // Microbiology (Reading). 2005. Vol. 151. Issue 8. P. 2551-2561. https://doi.org/10.1099/mic.0.28048-0

4. Bhaya D., Davison M., Barrangou R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation // Annual Review of Genetics. 2011. Vol. 45. P. 273-297. https://doi.org/10.1146/annurev-genet-110410-132430

5. Makarova K.S., Wolf Y.I., Alkhnbashi O.S., Costa F., Shah S.A., Saunders S.J., et al. An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems // Nature Reviews Microbiology. 2015. Vol. 13. Issue 11. P. 722-736. https://doi.org/10.1038/nrmicro3569

6. Shmakov S., Smargon A., Scott D., Cox D., Pyzocha N., Yan W., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems // Nature Reviews Microbiology. 2017. Vol. 15. Issue 3. P. 169-182. https://doi.org/10.1038/nrmicro.2016.184

7. Koonin E.V., Makarova K.S., Zhang F. Diversity, classification and evolution of CRISPR-Cas systems // Current Opinion in Microbiology. 2017. Vol. 37. P. 67-78. https://doi.org/10.1016/j.mib.2017.05.008

8. Hille F., Charpentier E. CRISPR-Cas: biology, mechanisms and relevance // Philosophical transactions of the royal society B: biological sciences. 2016. Vol. 371. Issue 1707. https://doi.org/10.1098/rstb.2015.0496

9. Byard R.W. Diphtheria - 'The strangling angel' of children // Journal of Forensic and Legal Medicine. 2013. Vol. 20. Issue 2. P. 65-68. https://doi.org/10.1016/jjflm.2012.04.006

10. Zasada A.A. Corynebacterium diphtheriae infections currently and in the past // Przeglad Epidemiologiczny. 2015. Vol. 69. Issue 3. P. 439-444.

11. Mattos-Guaraldi A.L., Moreira L.O., Damasco P.V., Hirata R. Diphtheria remains a threat to health in the developing world-an overview // Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 2003. Vol. 98. Issue 8. P. 987-993. https://doi.org/10.1590/s0074-02762003000800001

12. Zasada A.A. Nontoxigenic highly pathogenic clone of Corynebacterium diphtheriae, Poland, 2004-2012 // Emerging Infectious Diseases. 2013. Vol. 19. Issue 11. P. 1870-1872. https://doi.org/10.3201/eid1911.130297

13. Kolodkina V., Titov L., Sharapa T., Grimont F., Grimont P.A.D., Efstratiou A. Molecular epidemiology of C. diphtheriae strains during different phases of the diphtheria epidemic in Belarus // BMC Infectious Diseases. 2006. Vol. 6. P. 129-137. https://doi.org/10.1186/1471-2334-6-129

14. Sharma N.C., Efstratiou A., Mokrousov I., Mutreja A., Das B., Ramamurthy T. Diphtheria // Nature Reviews Disease Primers. 2019. Vol. 5. Issue 1. P. 81. https://doi.org/10.1038/s41572-019-0131-y

15. Paveenkittiporn W., Sripakdee S., Koobkratok O., Sangkitporn S., Kerdsin A. Molecular epidemiology and antimicrobial susceptibility of outbreak-associated Corynebacterium diphtheriae in Thailand, 2012 // Infection, Genetics and Evolution. 2019. Vol. 75. P. 104007. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2019.104007

16. Kneen R., Pham N.G., Solomon T., Tran T.M., Nguyen T.T., Tran B.L., et al. Penicillin vs. erythromycin in the treatment of diphtheria // Clinical Infectious Diseases. 1998. Vol. 27. Issue 4. P. 845850. https://doi.org/10.1086/514959

17. Pereira G.A., Pimenta F.P., Wink dos Santos F.R., Damasco P.V., Hirata R., Mattos-Guaraldi A.L. Antimicrobial resistance among Brazilian Corynebacterium diphtheriae strains // Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 2008. Vol. 103. Issue 5. P. 507-510. https://doi.org/10.1590/s0074-02762008000500019

18. Husada D., Soegianto S.D.P., Kurniawati I.S., Hendrata A.P., Irawan E., Kartina L., et al. First-line antibiotic susceptibility pattern of toxigenic Corynebacterium diphtheriae in Indonesia // BMC Infectious Diseases. 2019. Vol. 19. Issue 1. P. 1049. https://doi.org/10.1186/s12879-019-4675-y

19. Hennart M., Panunzi L.G., Rodrigues C., Gaday Qu., Baines S.L., Barros-Pinkelnig M., et al. Population genomics and antimicrobial resistance in Corynebacterium diphtheria // Genome Medicine. 2020. Vol. 12. Issue 1. P. 107. https://doi.org/10.1186/s13073-020-00805-7