Разработка пробиотика для животных и аквакультуры на основе штаммов Bacillus toyonensis В-13249 и Bacillus pumilus В-13250

Резюме: Цель настоящего исследования – разработать пробиотик для животных и аквакультуры на основе штаммов Bacillus toyonensis В-13249 и Bacillus pumilus В-13250. Осуществлен подбор питательной среды для культивирования посевного материала данных микроорганизмов, а также проведен ряд ферментаций бактерий рода Bacillus в биологических реакторах емкостью 15 и 250 л. Отработана технология получения готового пробиотика для животных и аквакультуры. Установлено, что L-бульон является наиболее оптимальной питательной средой для культивирования изученных штаммов. В ходе культивирования штаммов B. toyonensis В-13249 и B. pumilus В-13250 в ферментерах выявлено, что спорообразование начинается через 4–8 ч ферментации. На ферментативной среде, в отличие от вегетативной, бациллы развивают более высокие оптическую плотность (максимальное значение у штамма B. pumilus – 2,400±0,149), значение pH (максимальное значение у штамма B. toyonensis – 8,483±0,609) и титр (не менее 1010 КОЕ/г). Через 20–24 ч инкубирования оба штамма бацилл в ферментаторе почти полностью переходят в эндоспоры, это служит сигналом для начала центрифугирования биомассы. Получено: с 15-литрового ферментера – 83,3±6,1 г концентрата, с 250-литрового – 499,8±51,4 г. Численность бацилл в концентрированном состоянии для обоих штаммов составила не менее 1·1011 КОЕ/г. Для получения готового препарата бактериальные концентраты смешивали с мальтодекстрином до титра не менее 1·1010 КОЕ/г. Численность бактерий в препарате проверяли в течение года ежемесячно, значение менее 1·1010 КОЕ/г не было зафиксировано. Таким образом, для выращивания материнской культуры штаммов B. toyonensis В-13249 и B. pumilus В-13250 наиболее благоприятна L-среда, а для культивирования в ферментерах – ферментативная питательная среда. Срок хранения биопрепарата на основе бацилл – не менее 12 мес., в течение которых сохраняется не только титр бактерий (не менее 1·1010 КОЕ/г) и их жизнеспособность, но также поликомпонентность, цвет и консистенция препарата.

1. Муродова С.С., Давранов К.Д. Комплексные микробные препараты. Применение в сельскохозяйственной практике // Biotechnologia Acta. 2014. Т. 7. N 6. С. 92–101. https://doi.org/10.15407/biotech7.06.092

2. Ehling-Schulz M., Lereclus D., Koehler T.M. The Bacillus cereus Group: Bacillus species with pathogenic potential // Microbiology Spectrum. 2019. Vol. 7. Issue 3. P. 1–35. https://doi.org/10.1128/microbialspec.gpp3-0032-2018

3. Kivanç S.A., Takim M., Kivanç M., Gullulu G. Bacillus Spp. isolated from the conjunctiva and their potential antimicrobial activity against other eye pathogens // African Health Sciences. 2014. Vol. 14. Isue 2. P. 364–371. https://doi.org/10.4314/ahs.v14i2.11

4. Sharif M., Yazdani M., Almas Z., Ghias W., Qureshi R., Zakki S., et al. Bacillus species found antagonistic activity against bacteria isolated from currency notes in local circulation // Biomedical Letters. 2016. Vol. 2. Issue 2. P. 86–90.

5. Abbas A., Khan S.U., Khan W.U., Saleh T.A., Khan M.H.U., Ullah S., et al. Antagonist effects of strains of Bacillus spp. against Rhizoctonia solani for their protection against several plant diseases: Alternatives to chemical pesticides // Comptes Rendus Biologies. 2019. Vol. 342. Issue 5-6. P. 124–135. https://doi.org/10.1016/j.crvi.2019.05.002

6. Akarapisan A., Khamtham J., Kositratana W. Characterization of antagonistic–potential of Bacillus velezensis SK71 against bacterial brown spot on a terrestrial orchid (Habenaria lindleyana) // International Journal of Agricultural Technology. 2020. Vol. 16. Issue 1. P. 1–18.

7. Савустьяненко А.В. Механизмы действия пробиотиков на основе Bacillus subtilis // Актуальная инфектология. 2016. N 2 (11). С. 35–44.

8. Абрамкова Н.В. Сравнительная эффективность применения спорообразующих пробиотиков в технологии выращивания поросят // Вестник КрасГАУ. 2015. N 8. С. 173–176.

9. Ziaei-Nejad S., Rezaei M.H., Takami G.A., Lovett D.L., Mirvaghefi A.-R., Shakouri M. The effect of Bacillus spp. bacteria used as probiotics on digestive enzyme activity, survival and growth in the Indian white shrimp Fenneropenaeus indicus // Aquaculture. 2006. Vol. 252. Issue 2-4. P. 516–524. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2005.07.021

10. Sekar A., Kim M., Jeon H., Kim K. Screening and selection of bacteria inhibiting white spot syndrome virus infection to Litopenaeus vannamei // Biochemistry and Biophysics Reports. 2019. Vol. 19. Article number 100663. https://doi.org/10.1016/j.bbrep.2019.100663

11. Amoah K., Huang Q.-C., Tan B.-P., Zhang S., Chi S.-Y., Yang Q.-H., et al. Dietary supplementation of probiotic bacteria, Bacillus coagulans ATCC 7050, improves the growth performance, intestinal morphology, microflora, immune response, and disease confrontation of Pacific white shrimp, Litopenaeus vannamei // Fish and Shellfish Immunology. 2019. Vol. 87. P. 796–808. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2019.02.029

12. Bahrampour K., Afsharmanesh M., Khajen Bami M. Comparative effects of dietary Bacillus subtilis, Bacillus coagulans and Flavophospholipol supplements on growth performance, intestinal microflora and jejunal morphology of Japanese quail // Livestock Science. 2020. Vol. 239. Article number 104089. https://doi.org/10.1016/j.livsci.2020.104089

13. Ефименко Т.А., Маланичева И.А., Зенкова В.А., Королев А.М., Остерман И.А., Сергиев П.В. [и др.]. Изыскание антибиотиков, эффективных в отношении бактерий с лекарственной устойчивостью, на примере Bacillus pumilus продуцента антибиотика амикумацина А // Вестник Оренбургского государственного университета. 2014. N 13 (174). С. 27–31.

14. Ефременкова О.В., Габриэлян Н.И., Маланичева И.А., Ефименко Т.А., Сумарукова И.Г., Глухова А.А. [и др.]. Антимикробные свойства амикумацина А // Антибиотики и химиотерапия. 2017. Т. 62. N 1-2. С. 16–19.

15. Srisapoome P., Areechon N. Efficacy of viable Bacillus pumilus isolated from farmed fish on immune responses and increased disease resistance in Nile tilapia (Oreochromis niloticus): Laboratory and on-farm trials // Fish and Shellfish Immunology. 2017. Vol. 67. P. 199–210. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2017.06.018

16. Gao X.-Y., Liu Y., Miao L.-L., Li E.-W., Hou T.-T., Liu Z.-P. Mechanism of anti-Vibrio activity of marine probiotic strain Bacillus pumilus H2, and characterization of the active substance // AMB Express. 2017. Vol. 7. Issue 1. P. 1–10. https://doi.org/10.1186/s13568-017-0323-3

17. Thy H.T.T., Tri N.N., Quy O.M., Fotedar R., Kannika K., Unajak S., et al. Effects of the dietary supplementation of mixed probiotic spores of Bacillus amyloliquefaciens 54A, and Bacillus pumilus 47B on growth, innate immunity and stress responses of striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) // Fish & Shellfish Immunology. 2017. Vol. 60. P. 391–399. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2016.11.016

18. Jiménez G., Urdiain M., Cifuentes A., López- López A., Blanch A.R., Tamames J., et al. Description of Bacillus toyonensis sp. nov., a novel species of the Bacillus cereus group, and pairwise genome comparisons of the species of the groupby means of ANI calculations // Systematic and Applied Microbiology. 2013. Vol. 36. Issue 6. P. 383–391. https://doi.org/10.1016/j.syapm.2013.04.008

19. Kantas D., Papatsiros V.G., Tassis P.D., Giavasis I., Bouki P., Tzika E.D. A feed additive containing Bacillus toyonensis (Toyocerin(®) ) protects against enteric pathogens in postweaning piglets // Journal of Applied Microbiology. 2015. Vol. 118. Issue 3. P. 727–738. https://doi.org/10.1111/jam.12729

20. Pinheiro V., Mourão J.L., Jimenez G. Influence of Toyocerin® (Bacillus cereus var. toyoi) on the breeding performances of primiparous rabbit does // World Rabbit Science. 2007. Vol.15. Issue 4. P. 179–188. https://doi.org/10.4995/wrs.2007.590

21. Cruz P.M., Ibañez A.L., Hermosillo O.A.M., Saad H.C.R. Use of probiotics in aquaculture // International Scholarly Research Network. 2012. Vol. 2012. Article ID 916845. 13 p. https://doi.org/10.5402/2012/916845

22. Пат. № 2693439, Российская Федерация. Штамм бактерий Bacillus toyonensis ВКПМ В-13249, обладающий выраженным антагонизмом по отношению к микроорганизмам Escherichia coli, Candida albicans, Staphylococcus aureus, St. epidermidis, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa / А.Н. Иркитова, А.В. Гребенщикова; патентообладатель ФГБОУ ВО «Алтайский государственный университет»; заявл. 25.12.2018; опубл. 02.07.2019.

23. Пат. № 2694522, Российская Федерация. Штамм бактерий Bacillus pumilus ВКПМ В-13250, обладающий выраженным антагонизмом по отношению к микроорганизмам Escherichia coli, Candida albicans, Staphylococcus aureus, St. epidermidis / А.Н. Иркитова, А.В. Гребенщикова; патентообладатель ФГБОУ ВО «Алтайский государственный университет»; заявл. 25.12.2018; опубл. 16.07.2019.

24. Иркитова А.Н., Гребенщикова А.В., Яценко Е.С., Сперанская Н.Ю., Мацюра А.В. Морфологическое разнообразие Bacillus subtilis // Ukrainian Journal of Ecology. 2018. Т. 8. N. 2. C. 365–370. https://doi.org/10.15421/2018_355