Применение сканирующей электронной микроскопии и ИК-спектроскопии для экспресс-оценки морфологии и химического состава бактериальных пленок при периодическом культивировании

Основной формой существования бактерий в природе являются биопленки – прикрепленные к субстрату ассоциации клеток, окруженные полимерным матриксом. Изучение образования и функционирования биопленок имеет фундаментальное значение для управления процессами формирования микробных ассоциатов в экологии, биотехнологии и медицине. Поставленная цель требует разработки аналитических подходов, позволяющих при сохранении интактной структуры биопленок получать оперативную информацию на протяжении всего цикла жизнедеятельности микробного сообщества. В задачу работы входила адаптация методов сканирующей электронной микроскопии и ИК-спектроскопии в качестве экспресс-метода анализа микробных биопленок. Для этого проведено сопоставительное изучение кинетики роста культуры бактерий Bacillus subtilis в течение 24 ч культивирования на твердом субстрате методами классической микробиологии и биохимии, электронной сканирующей микроскопии и Фурье ИК-спектроскопии. Установлено, что морфология биопленки меняется от равномерного заселения поверхности носителя планктонными клетками на начальной стадии роста (6 ч) до накопления внеклеточного матрикса и образования микроколоний в экспоненциальной и стационарной фазе (12–18 ч) и постепенного истощения матрикса в фазе отмирания клеток (24 ч). Результаты ИК-спектроскопии коррелируют с результатами биохимических исследований, что, в свою очередь, позволяет проводить оперативную оценку накопления белков, полисахаридов и нуклеиновых кислот и получать информацию об их структурном состоянии в биопленке. По итогам исследования можно заключить, что сканирующая электронная микроскопия и Фурье ИК-спектроскопия в предложенном варианте применения позволяют получать взаимодополняющую информацию о морфологии и химическом составе микробных биопленок в процессе культивирования.

1. Abed S. E., Ibnsouda S. K., Latrache H., Hamadi F. Scanning electron microscopy (SEM) and environmental SEM: suitable tools for study of adhesion stage and biofilm formation. IntechOpen, 2012. 830 p. https://doi.org/10.5772/34990.

2. Preisner O., Lopes J. A., Guiomar R., Machado J., Menezes J. C. Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy in bacteriology: towards a reference method for bacteria discrimination // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2007. Vol. 387, no. 5. P. 1739-1748. https://doi.org/10.1007/s00216-006-0851-1.

3. Уткин Д. В., Куклев В. Е., Ерохин П. С., Осина Н. А. Применение методов спектроскопии для индикации и идентификации патогенных биологических агентов // Проблемы особо опасных инфекций. 2011. N 2. С. 68-71. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2011-2(108)-68-71.

4. Рой А. А., Курдиш И. К., Остапюк С. Н., Савельев Ю. В. Влияние условий культивирования Bacillus subtilis ИМВ B-7023 и его стрептомицинустойчивого мутанта на свойства поверхности этих бактерий // Мікробіологічний журнал. 2017. Т. 79. N 4. С. 12-20.

5. Сунцова А. Ю., Гулиев Р. Р., Попов Д. А., Вострикова Т. Ю., Дубоделов Д. В., Щеголихин А. Н. [и др.]. Идентификация микроорганизмов с помощью инфракрасных Фурье-спектров // Вестник Российского государственного медицинского университета. 2018. N 4. С. 57-65. https://doi.org/10.24075/vrgmu.2018.046.

6. Rodriguez-Saona L. E., Khambaty F. M., Fry F. S., Dubois J., Calvey E. M. Detection and identification of bactеria in a juce matrix with Fourier transform-near infrared spectroscopy and multivariate analysis // Journal of Food Protection. 2004. Vol. 67, no. 11. P. 2555-2559. https://doi.org/10.4315/0362-028x-67.11.2555.

7. Rebuffo C. A., Schmitt J., Wenning M., von Stetten F., Scherer S. Reliable and rapid identification of Listeria monocytogenes and Listeria species by artificial neural network-based Fourier transform infrared spectroscopy // Applied and Environmental Microbiology. 2006. Vol. 72, no. 2. P. 994-1000. https://doi.org/10.1128/AEM.72.2.994-1000.2006.

8. Wenning M., Buchl N. R., Scherer S. Species and strain identification of lactic acid bacteria using FTIR spectroscopy and artificial neural networks // Journal of Biophotonics. 2010. Vol. 3, no. 8-9. P. 493-505. https://doi.org/10.1002/jbio.201000015.

9. Ma W., Peng D., Walker S. L., Cao B., Gao C.-H., Huang Q., et al. Bacillus subtilis biofilm development in the presence of soil clay minerals and iron oxides // NPJ. Biofilms and Microbiomes. 2017. Vol. 3. Article number: 4. https://doi.org/10.1038/s41522-017-0013-6.

10. Humbert F., Quilès F. In-situ study of early stages of biofilm formation under different environmental stresses by ATR-FTIR spectroscopy. In: Science against microbial pathogens: communicating current research and technological advances. Badajoz: Formatex Research Center, 2011. P. 889-895.

11. Tugarova A. V., Scheludko A. V., Dyatlova Yu. A., Filip’echeva Yu. A., Kamnev A. A. FTIR spectroscopic study of biofilms formed by the rhizobacterium Azospirillum brasilense Sp245 and its mutant Azospirillum brasilense Sp245.1610 // Journal of Molecular Structure. 2017. Vol. 1140. P. 142-147. https://doi.org/10.1016/j.molstruc.2016.12.063.

12. Кобелев А. В., Клементьев С. В., Вдовина Т. В., Сироткин А. С. Оценка активности внеклеточных лектинов бактерий в формировании агрегированных микробных форм // Бутлеровские сообщения. 2021. Т. 65. N 1. С. 105-113. https://doi.org/10.37952/ROI-jbc-01/21-65-1-105.

13. Merritt J. H., Kadouri D. E., O’Toole G. A. Growing and analyzing static biofilms // Current Protocols in Microbiology. 2005. https://doi.org/10.1002/9780471729259.mc01b01.

14. Хабибуллина А. Р., Вдовина Т. В., Кобелева Й. В., Сироткин А. С. Исследование процесса биологической дефосфотации модельных сред с использованием фосфатаккумулирующих бактерий // Вестник технологического университета. 2017. Т. 20. N 19. С. 131-133.

15. Годовалов А. П., Карпунина Т. И. Определение компонентного состава биопленок грамположительных бактерий // Клиническая лабораторная диагностика. 2019. Т. 64. N 10. С. 632-634. https://doi.org/10.18821/0869-2084-2019-64-10-632-634.

16. Nayak N., Nag T. C., Satpathy G., Ray S. B. Ultrastructural analysis of slime positive & slime negative Staphylococcus epidermidis isolates in infectious keratitis // Indian Journal of Medical Research. 2007. Vol. 125, no. 6. P. 767-771.

17. Litvinov R. I., Faizullin D. A., Zuev Yu. F., Weisel J. W. The a-helix to β-sheet transition in stretched and compressed hydrated fibrin clots // Biophysical Journal. 2012. Vol. 103, no. 5. P. 1020-1027. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2012.07.046.

18. Wang H., Ding S., Wang G., Xu X., Zhou G. In situ characterization and analysis of Salmonella biofilm formation under meat processing environments using a combined microscopic and spectroscopic approach // International Journal of Food Microbiology. 2013. Vol. 167, no. 3. P. 293-302. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2013.10.005.

19. Gieroba B., Krysa M., Wojtowicz K., Wiater A., Pleszczyńska M., Tomczyk M., et al. The FTIR and raman spectroscopies as tools for biofilm characterization created by cariogenic streptococci // International Journal of Molecular Sciences. 2020. Vol. 21, no. 1. P. 3811. https://doi.org/10.3390/ijms21113811.

20. McCutcheon J., Southam G. Advanced biofilm staining techniques for TEM and SEM in geomicrobiology: Implications for visualizing EPS architecture, mineral nucleation, and microfossil generation // Chemical Geology. 2018. Vol. 498. P. 115-127. https://doi.org/10.1016/j.chemgeo.2018.09.016.

21. Ярец Ю. И., Шевченко Н. И. Новый метод анализа бактериальной биопленки // Наука и инновации. 2016. N 10. С. 64‒68.

22. Клементьев С. В., Кобелев А. В., Сироткин А. С. О формировании клеточных агрегатов под действием бактериальных лектинов // Пищевые технологии и биотехнологии: материалы ХVII Всероссийской конференции молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием, посвященная Году науки и технологий в Российской Федерации (г. Казань, 20-23 апреля 2021 г.). Казань: КНИТУ, 2021. С. 453-458.

23. Branda S. S., Chu F., Kearns D. B., Losick R., Kolter R. A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix // Molecular Microbiology. 2006. Vol. 59, no. 4. P. 1229-1238. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2005.05020.x.

24. Epstein A. K., Pokroy B., Seminara A., Aizenberg J. Bacterial biofilm shows persistent resistance to liquid wetting and gas penetration // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2010. Vol. 108, no. 3. P. 995-1000. https://doi.org/10.1073/pnas.1011033108.

25. Бисенова Г. Н., Торина А. К., Шегебаева А. А. Изучение динамики роста бактерий родов Bacillus и Pseudomonas при периодическом культивировании // Вестник науки Казахского агротехнического университета им. С. Сейфуллина. 2014. Т. 82. N 3. C. 3-9.

26. Шарипова М. Р., Марданова А. М., Рудакова Н. Л., Пудова Д. С. Бистабильность и формирование матрикса биопленки как механизмы адаптации Bacillus subtilis в стационарной фазе // Микробиология. 2021. Т. 90. N 1. С. 24-42. https://doi.org/10.31857/S0026365620060178.