Получение полигидроксиалканоата с помощью культуры Pseudomonas helmanticensis в нестерильных средах, содержащих глицерин и додецилсульфат натрия

Получаемые биосинтетическим путем с помощью бактерий Pseudomonas поли-3-гидроксиалканоаты (ПГА) являются перспективной заменой традиционных пластиков. Снизить стоимость производства ПГА за счет уменьшения энергозатрат можно при использовании питательных сред, не прошедших паровую стерилизацию. Культивирование бактерий Pseudomonas, устойчивых к додецилсульфату натрия (SDS), на содержащих SDS нестерильных средах позволяет получить биомассу, состоящую преимущественно из продуцента ПГА. При этом SDS играет роль антимикробного агента, подавляющего рост посторонних микроорганизмов. В настоящей работе использовалась SDS-устойчивая культура Pseudomonas helmanticensis и среды, содержащие глицерин и SDS. Концентрации источников углерода (глицерин) и азота оптимизированы с помощью эксперимента, поставленного по центральному композиционному ротатабельному плану. Варьировались концентрация субстрата C и соотношение C/N между содержанием в среде глицерина и источника азота. Построение зависимости степени конверсии субстрата в ПГА от С и C/N проводилось в среде программирования R. Построенная модель адекватно описывает экспериментальные данные при уровне значимости 0,05 (дисперсия адекватности регрессионного уравнения 4,1×10^-2, R² =0,98). Рассчитанная с помощью модели степень конверсии глицерина в ПГА составляет 6,9±0,4%. В оптимизированных условиях (0,61 г/л источника азота, 8,4 г/л глицерина, 96 ч) P. helmanticensis конвертирует 7,0% субстрата в ПГА со средней длиной мономерных звеньев. С помощью метагеномного анализа 16S рРНК показано, что доля посторонних бактерий при культивировании P. helmanticensis на нестерильной среде, содержащей 0,5 г/л SDS, составляет 2%.

1. Junyu Z., Shishatskaya E. I., Volova T. G., da Silva L. F., Chen G.-Q. Polyhydroxyalkanoates (PHA) for therapeutic applications. Materials Science and Engineering: C. 2017;86:144-150. https://doi.org/10.1016/j.msec.2017.12.035.

2. Ruiz C., Kenny S. T., Narancic T., Babu R., O’ Connor K. Conversion of waste cooking oil into medium chain polyhydroxyalkanoates in a high cell density fermentation. Journal of Biotechnology. 2019;306:9-15. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2019.08.020.

3. Kumar M., You S., Beiyuan J., Tsang D. C. W., Luo G., Gupta J., et al. Lignin valorization by bacterial genus Pseudomonas: state-of-the-art review and prospects. Bioresource Technology. 2021;320:124412. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2020.124412.

4. Mannina G., Presti D., Montiel-Jarillo G., Carrera J., Suarez-Ojeda M. E. Recovery of polyhydroxyalkanoates (PHAs) from wastewater: a review. Bioresource Technology. 2020;297:122478. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2019.03.037.

5. Marang L., van Loosdrecht M. C. M., Kleerebezem R. Combining the enrichment and accumulation step in non-axenic PHA production: cultivation of Plasticicumulans acidivorans at high volume exchange ratios. Journal of Biotechnology. 2016;231:260-267. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2016.06.016.

6. Tan D., Xue Y.-S., Aibaidula G., Chen G.-Q. Unsterile and continuous production of polyhydroxybutyrate by Halomonas TD01. Bioresource Technology. 2011;102(17):8130-8136. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2011.05.068.

7. Johnston M. D., Simons E.-A., Lambert R. J. W. One explanation for the variability of the bacterial suspension test. Journal of Applied Microbiology. 2000;88(2):237-242. https://doi.org/10.1046/j.1365-2672.2000.00951.x.

8. Nepomnyashchiy A. P., Shishlyannikov S. M., Shpironok O. G., Alekseeva A. A., Zubkov I. N., Sitnov V. Yu. Soil SDS-degrading bacterium Pseudomonas helmanticensis as a potential producer of polyhydroxyalkanoates. In: Current trends of agricultural industry in global economy: XIX International Scientific and Practical Conference. Kemerovo, 2021. p. 182-189. https://doi.org/10.32743/agri.gl.econ.2020.182-189.

9. Poblete-Castro I., Wittmann C., Nike P. I. Biochemistry, genetics and biotechnology of glycerol utilization in Pseudomonas species. Microbial Biotechnology. 2020;13(1):32-53. https://doi.org/10.1111/1751-7915.13400.

10. Sabapathy P. C., Devaraj S., Meixner K., Anburajan P., Kathirvel P., Ravikumar Y., et al. Recent developments in polyhydroxyalkanoates (PHAs) production in the past decade – a review. Bioresource Technology. 2020;306:123132. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2020.123132.

11. Saranya V., Shenbagarathai R. Effect of nitrogen and calcium sources on growth and production of PHA of Pseudomonas sp. LDC-5 and its mutant. Current Research Journal of Biological Sciences. 2010;2(3):164-167.

12. Ojhaa N., Das N. A statistical approach to optimize the production of polyhydroxyalkanoates from Wickerhamomyces anomalus VIT-NN01 using response surface methodology. International Journal of Biological Macromolecules. 2018;107:2157-2170. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2017.10.089.

13. Zain N. F. M., Paramasivam M., Tan J. S., Lim V., Lee C. K. Response surface methodology optimization of polyhydroxyalkanoate (PHA) production by Burkholderia cepacia BPT1213 using waste glycerol from palm oil based biodiesel production. Biotechnology Progress. 2021;37(1):e3077. https://doi.org/10.1002/btpr.3077.

14. Pokoj T., Klimiuk E., Ciesielski S. Interactive effect of crude glycerin concentration and C:N ratio on polyhydroxyalkanoates accumulation by mixed microbial cultures modelled with response surface methodology. Water Research. 2019;156:434-444. https://doi.org/10.1016/j.watres.2019.03.033.

15. Zubkov I. N., Nepomnyshchiy A. P., Kondratyev V. D., Sorokoumov P. N., Sivak K. V., Ramsay E. S., et al. Adaptation of Pseudomonas helmanticensis to fat hydrolysates and SDS: fatty acid response and aggregate formation. Journal of Microbiology. 2021;59(11):1104–1111. https://doi.org/10.1007/s12275-021-1214-5.

16. Rebocho A. T., Pereira J. R., Freitas F., Neves L. A., Alves V. D., Sevrin C., et al. Production of medium-chain-length polyhydroxyalkanoates by Pseudomonas citronellolis grown in apple pulp waste. Applied Food Biotechnology. 2019;6(1):71-82. http://dx.doi.org/10.22037/afb.v6i1.21793.

17. Kondratyev V. D., Goryacheva D. I., Nepomnyaschiy A. P., Zubkov I. N., Shishlyannikov S. M., Sorokoumov P. N. Quantitative analysis of medium-chain polyhydroxyalkanoates in bacterial cells via gas chromatography-mass spectrometry: classical method revision and optimization. International Journal of Polymer Analysis and Characterization. 2022;27(1):32-42. https://doi.org/10.1080/1023666X.2021.1992581.

18. Kozich J. J., Westcott S. L., Baxter N. T., Highlander S. K., Schloss P. D. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform. Applied and Environmental Microbiology. 2013;79(17):5112-5120. https://doi.org/10.1128/AEM.01043-13.

19. Schlusselhuber M., Godard J., Sebban M., Bernay B., Garon D., Seguin V., et al. Characterization of milkisin, a novel lipopeptide with antimicrobial properties produced by Pseudomonas sp. UCMA 17988 isolated from bovine raw milk. Frontiers in Microbiology. 2018;9:1030. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.01030.