Влияние гиперэкспрессии гена альтернативной внешней NADH-дегидрогеназы арабидопсиса на устойчивость трансформированных растений табака к отрицательной температуре

Целью исследования являлось подтверждение функциональной активности и локализации трансгенного белка At_NDB2 арабидопсиса в клетках табака, а также оценка влияния перманентной экспрессии «внешней» альтернативной NADH-дегидрогеназы на устойчивость теплолюбивого растения к низкой температуре. Белок и митохондрии выделяли из листьев растений табака, выращенных при 25 °С (день/ночь) на стадии 7 листьев. С помощью электрофореза и иммуноблоттинга показана локализация белка At_NDB2 в митохондриях. Функциональная активность At_NDB2 подтверждена с помощью полярографии изолированных митохондрий и специфического ингибитора комплекса I митохондрий ротенона. Также выявлено, что у трансгенных растений скорость цианидрезистентного дыхания и активность фермента альтернативной оксидазы существенно выше, чем у растений дикого типа. Для определения устойчивости к низким температурам исходные и трансгенные растения табака в почвогрунте выращивали до стадии 2–3 и 6–7 листьев, после чего выдерживали при температуре от 3 до минус 3 °С в течение суток в темноте и оставляли для отрастания при 25 °С на 7 суток. Установлено, что устойчивость трансгенных и нетрансформированных растений не отличается, хотя ранее было показано, что у трансгенных растений окислительный стресс при низкой температуре снижен по сравнению с растениями дикого типа. Таким образом, было обнаружено, что активность альтернативной NADH-дегидрогеназы снижает окислительный стресс, увеличивает активность альтернативной оксидазы, но не повышает устойчивость Nicotiana tabacum к отрицательной температуре.

1. Michalecka A.M., Svensson A.S., Johansson F.I., Agius S.C., Johanson U., Brennicke A., et al. Arabidopsis genes encoding mitochondrial type II NAD(P)H dehydrogenases have different evolutionary origin and show distinct responses to light. Plant Physiology. 2003;133(2):642-652. DOI: 10.1104/pp.103.024208.

2. Elhafez D., Murcha M.W., Clifton R., Soole K.L., Day D.A., Whelan J. Characterization of mitochondrial alternative NAD(P)H dehydrogenases in Arabidopsis: intraorganelle location and expression. Plant and Cell Physiology. 2006;47(1):43-54. DOI: 10.1093/pcp/pci221.

3. Møller I.M. Plant mitochondria and oxidative stress: electron transport, NADPH turnover, and metabolism of reactive oxygen species. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 2001;52(1):561-591. DOI: 10.1146/annurev.arplant.52.1.561.

4. Sweetman C., Waterman C.D., Rainbird B.M., Smith P.M.C., Jenkins C.D., Day D.A., et al. AtNDB2 is the main external NADH dehydrogenase in mitochondria and is important for tolerance to environmental stress. Plant Physiology. 2019;181(2):774-788. DOI: 10.1104/pp.19.00877.

5. Yerlikaya B.A., Ates D., Abudureyimu B., Aksoy E. Effect of climate change on abiotic stress response gene networks in Arabidopsis thaliana. In: Prakash C.S., Fiaz S., Fahad S. (eds). Principles and practices of OMICS and genome editing for crop improvement. Cham: Springer; 2022, p. 149-172.

6. Stupnikova I., Benamar A., Tolleter D., Grelet J., Borovskii G., Dorne A.J., Macherel D. Pea seed mitochondria are endowed with a remarkable tolerance to extreme physiological temperatures. Plant Physiology. 2006;140(1):326-335. DOI: 10.1104/pp.105.073015.

7. Jethva J., Lichtenauer S., Schmidt-Schippers R., Steffen-Heins A., Poschet G., Wirtz M., et al. Mitochondrial alternative NADH dehydrogenases NDA1 and NDA2 promote survival of reoxygenation stress in Arabidopsis by safeguarding photosynthesis and limiting ROS generation. New Phytologist. 2023;238(1):96-112. DOI: 10.1111/nph.18657.

8. Alizadeh R., Kumleh H.H., Rezadoost M.H. The simultaneous activity of cytosolic and mitochondrial antioxidant mechanisms in neutralizing the effect of drought stress in soybean. Plant Physiology Reports. 2023;28(1):78-91. DOI: 10.1007/s40502-022-00704-6.

9. Borovskii G.B., Korotaeva N.E., Katyshev A.I., Fedoseeva I.V., Fedyaeva A.V., Kondakova M.A., et al. The overexpression of the Arabidopsis NDB2 gene in tobacco plants affects the expression of genes encoding the alternative mitochondrial electron transport pathways and stress proteins. In: Plant Genetics, Genomics, Bioinformatics, and Biotechnology: abstracts of the 6th International scientific conference. 14–18 June 2021, Novosibirsk. Novosibirsk; 2021, p. 42.

10. Korotaeva N.E., Shigarova A.M., Katyshev A.I., Fedoseeva I.V., Fedyaeva A.V., Sauchyn D.V., et al. Effect of expression of the NDB2 heterologous gene of Arabidopsis thaliana on growth and respiratory activity of Nicotiana tabacum. Russian Journal of Plant Physiology. 2023;70:93. DOI: 10.1134/S1021443723600885.

11. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 1962;15(3):473-497. DOI: 10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x.

12. Hameed M.W., Juszczak I., Bock R., van Dongen J.T. Comparison of mitochondrial gene expression and polysome loading in different tobacco tissues. Plant Methods. 2017;13:112. DOI: 10.1186/s13007-017-0257-4.

13. Grabelnykh O.I., Yakovenko K.V., Polyakova E.A., Korsukova A.V., Stepanov A.V., Fedotova O.A., et al. Functioning of mitochondria in transgenic potato tubers with the gox gene for glucose oxidase from Penicillium funiculosum during different storage periods. Russian Journal of Plant Physiology. 2022;69:112. DOI: 10.1134/S1021443722060097.

14. Garmash E.V., Velegzhaninov I.O., Ermolina K.V., Rybak A.V., Malyshev R.V. Altered levels of AOX1a expression result in changes in metabolic pathways in Arabidopsis thaliana plants acclimated to low dose rates of ultraviolet B radiation. Plant Science. 2020;291:110332. DOI: 10.1016/j.plantsci.2019.110332.

15. Clifton R., Lister R., Parker K.L., Sappl P.G., Elhafez D., Millar A.H., et al. Stress-induced co-expression of alternative respiratory chain components in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 2005;58:193-212. DOI: 10.1007/s11103-005-5514-7.

16. Yoshida K., Noguchi K. Differential gene expression profiles of the mitochondrial respiratory components in illuminated Arabidopsis leaves. Plant and Cell Physiology. 2009;50(8):1449-1462. DOI: 10.1093/pcp/pcp090.

17. Smith C., Barthet M., Melino V., Smith P., Day D., Soole K. Alterations in the mitochondrial alternative NAD(P) H dehydrogenase NDB4 lead to changes in mitochondrial electron transport chain composition, plant growth and response to oxidative stress. Plant and Cell Physiology. 2011;52(7):1222-1237. DOI: 10.1093/pcp/pcr073.

18. Sweetman C., Waterman C.D., Wong D.C.J., Day D.A., Jenkins C.L.D, Soole K.L. Altering the balance between AOX1A and NDB2 expression affects a common set of transcripts in Arabidopsis. Frontiers in Plant Science. 2022;13:876843. DOI: 10.3389/fpls.2022.876843.

19. Wanniarachchi V.R., Dametto L., Sweetman C., Shavrukov Y., Day D.A., Jenkins C.L.D., et al. Alternative respiratory pathway component genes (AOX and ND) in rice and barley and their response to stress. International Journal of Molecular Sciences. 2018;19(3):915. DOI: 10.3390/ijms19030915.

20. Liu Y.J., Norberg F.E.B., Szilágyi A., De Paepe R., Åkerlund H.-E., Rasmusson A.G. The mitochondrial external NADPH dehydrogenase modulates the leaf NADPH/NADP+ ratio in transgenic Nicotiana sylvestris. Plant and Cell Physiology. 2008;49(2):251-263.